Att visualisera biologiska celler under ett mikroskop blev bara tydligare, tack vare forskning utförd av doktorand Yifei Jiang och huvudutredare Jason McNeill från Clemson Universitys avdelning för kemi.

Med hjälp av Rhonda Powell och Terri Bruce från Clemson's Light Imaging Facility, teamet kunde utveckla en nanopartikel "switch" som fluorescerar för att skärpa upplösningen av mikroskopiska bilder som visar små cellulära strukturer. Som nyligen publicerats i Nanobokstäver , denna omkopplare förbättrar en bildbehandlingsmetod som vann 2014 års Nobelpris i kemi.

Eftersom cellulära strukturer avger ljus vid våglängder mindre än 400-700 nanometer på det elektromagnetiska spektrumet, de verkar ofta suddiga genom ett ljusmikroskop. Denna begränsning kallas diffraktionsgränsen, och det uppstår på grund av ljusets vågegenskaper. När ljus passerar runt strukturer i biologiska celler, det böjer, eller böjar, till en punkt som ljusmikroskop inte klart kan lösa. 2014 års prisbelönta avbildningsmetod - enmolekylär lokaliseringsmikroskopi - uppfanns för att överträffa denna begränsning.

"Enkelmolekyllokaliseringsmikroskopi är baserad på molekylära 'fotoswitchar' - fluorescerande molekyler som du kan slå på och av, som en ljusströmbrytare, att slå diffraktionsgränsen, ", sa McNeill. "Med den här avbildningsmetoden, provet avbildas en fluorescerande molekyl i taget och en dator används för att konstruera en bild som är mycket skarpare än vad du kan få med ett vanligt ljusmikroskop."

Fångsten, dock, är att fluorescensen som tillhandahålls av fotoswitchar i bästa fall är svag, med endast en liten förbättring av bildupplösningen. Enkelmolekyllokaliseringsmikroskopi kräver också specialiserad utrustning som kan vara dyr att skaffa.

Cue the "buckyswitch" - Clemson-forskarnas förbättrade version av en fotoswitch. Den här nya typen av nanopartiklar behåller fotoswitchens på-av-förmåga, men är 10 gånger ljusare och lättare att använda. Det gör också att mikroskop kan ta bilder upp till terapixelnivån. (Det motsvarar en biljon pixlar, eller en miljon megapixlar.)

"Dessa nanopartiklar är de första fotoomkopplarna som uppnår precision ner till cirka 1 nanometer, vilket avsevärt förbättrar upplösningen för superupplöst bildbehandling, " sade Jiang. "Också, vår metod kräver bara en excitationsljuskälla, där konventionella superupplösningstekniker kräver två lasrar; Således, vi har förenklat mikroskopinställningen."

Jiang satte ihop buckyswitch ur ett lysrör, halvledande konjugerad polymer komplexbunden med ett kemiskt derivat av buckminsterfulleren:en fotbollsbollformad form av kol.

"Den svåra delen med att göra en fluorescerande nanopartikel som du kan slå på och av är att det finns många områden som avger fluorescens på en gång, " sade McNeill. "I fallet med fluorescerande konjugerad polymer, det finns dussintals eller hundratals kedjesegment. Du kan försöka göra många små switchar för varje segment, men det är svårt att få dem att stänga av samtidigt. Du kan inte få dem synkroniserade."

Genom att lägga till derivatet av buckminsterfulleren, kallas PCBM, för att göra buckyswitches, en "master switch" bildas som reglerar atomladdningen av polymerens segment, därmed synkronisera fluorescens. PCBM kan gripa elektroner från polymersegmentet, vilket ger segmentet en övergripande positiv laddning. Denna positiva laddning minskar fluorescensen av närliggande segment, som har en dominoeffekt som stänger av fluorescens i hela nanopartikeln.

Bruce - vars bakgrund korsar ämnena kemiteknik, tillämpad biologi, cellbiologi, och erfarenhet av undervisning och industri - liknar denna bildbehandlingsmetod med utsikten över en hängbro på natten.

"Brons trådar är ofta upplysta, och när du står långt borta från bron, ljusen ser ut som ett kontinuerligt "rep" av ljus, istället för enskilda lökar. Dock, om du kan få glödlamporna att blinka - så att bara varannan glödlampa är "tänd" när som helst - kan dina ögon urskilja de enskilda glödlamporna på långt håll, "Bruce sa. "Grunden för superupplösningsmikroskopi ligger i förmågan att få fluorescerande etiketter att "blinka" precis som lamporna på bron. Arbetet som Dr. McNeills labb gör är avgörande för utvecklingen av denna teknik eftersom den fokuserar på att göra dessa individuella blinkningar mycket ljusare, så att våra nuvarande fotondetektorer faktiskt kan se blinkningarna. Om vi ​​kan se blinkningarna med en kamera eller annan fotondetektor, vi kan kartlägga var blinkningen sker, och skapa en bild där vi kan urskilja två ljuspunkter som ligger inom 10-20 nanometer från varandra. "

När buckyswitchen väl syntetiserats, Jiang testade det i E. coli, men inte innan man utvecklat ett unikt tillväxtmedium för bakterierna. Vanligtvis, E. coli odlas i media som är autofluorescerande, vilket betyder att det naturligt avger ljus. Utan rätt media, buckyswitchens fluorescens skulle skymmas av bakgrundsljus, något som Powell underströk.

"En studie som den Yifei genomförde krävde väldigt lite bakgrundsfluorescens, så jag undersökte mediakomponenter som skulle vara mindre benägna att vara autofluorescerande och förberedde ett "recept" för en icke-konventionell, mindre autofluorescerande näringsmedia för bakterieodling, sa Powell, som studerade både biologiska vetenskaper och mikrobiologi vid Clemson innan han blev forskningslabbchef för Clemson Light Imaging Facility. Powell och Bruce arbetade också för att förse Jiang med E. coli för studien.

Efter att alla de nödvändiga komponenterna hade tagits bort, Jiang fäste nanopartikelns buckyswitch till ytan av E. coli. Som hoppats, buckyswitcharna avgav små ljusglimtar, vilket gjorde det möjligt för forskarna att bestämma sina exakta positioner. De satte sedan ihop varje ljusblixt för att rekonstruera formen på E. coli, ger en superupplöst bild.

"Vi hoppas att detta genombrott så småningom kommer att kunna hjälpa forskare att hantera svåra problem inom biologi, som leder till genombrott i förståelsen och behandlingen av sjukdomar, ", sa Clemson-teamet.

Teamet designade buckyswitcharna för att fungera med standard fluorescerande mikroskop och gratis programvara som är tillgänglig online, gör tekniken billig och tillgänglig för laboratorier över hela världen.

Deras publicering, med titeln "Förbättrad superupplösningsavbildning med hjälp av telegrafbrus i organiska halvledarnanopartiklar, " finns med i numret av 14 juni Nanobokstäver .