Det är för närvarande utmanande att direkt observera bildandet av intracellulära nanostrukturer i labbet. I en ny rapport, Miaomiao Zhang och ett forskarlag inom kemi, biovetenskap, medicinsk teknik och vetenskap och teknik, i Kina, använde en rationellt utformad liten molekyl förkortad NBC-Iod-CBT (förkortning för 4-nitrobensylkarbamat-Cys(SEt)-Asp-Asp-Phe(jod)-2-cyano-bensotiazol) och direkt observerad intracellulär nanopartikelbildning med nanodatortomografi ( nano-CT).

Under experimenten, mekanismerna för reduktion av glutation (GSH) och nitroreduktas (NTR) fick NBC-Iod-CBT-molekyler att genomgå en klickkondensationsreaktion och självmontera nanopartiklar (NPs) som Iod-CBT-NPs. När teamet genomförde nano-CT-avbildning av NBC-Iod-CBT-behandlade, nitroreduktas-uttryckande HeLa-celler i labbet, de visade förekomsten av självmonterade Iod-CBT-NPs i deras cytoplasma. Den nya strategin publiceras nu på Vetenskapens framsteg och kommer att hjälpa livsforskare och bioingenjörer att förstå bildandet av intracellulära nanostrukturer.

En smart strategi för nanomontering

Att montera nanostrukturer med små molekylära prekursorer inuti celler är en intelligent strategi med stora fördelar inom molekylär avbildning och läkemedelsleverans. Små molekyler kan lätt tas upp av celler, men de rensas också snabbt. I kontrast, nanostrukturer med terapeutiska medel har längre retentionstidsramar i celler med högre potens. Ändå, det är mycket svårare för en cell att ta upp en nanostruktur jämfört med en liten molekyl. Forskare aktiverar därför nanostrukturer för cellulärt upptag genom att modifiera cellytan med inriktning mot stridsspetsar, men sådana modifieringar kan sänka reproducerbarheten av nanokomplexet. Som ett resultat, en nyligen utvecklad smart metod syftar till att bilda intracellulära nanopartiklar, där cellkulturer inkuberade med en liten molekylär prekursor kommer att ha en nanostruktur i sig, för spännande tillämpningar inom molekylär avbildning och läkemedelsleverans. Dock, det är fortfarande svårt att skilja mellan de artificiellt formade nanostrukturerna från inneboende cellulära strukturer. För att åstadkomma detta, Zhang et al. designade först en jod (jod)-innehållande liten molekylprekursor, de utsatte sedan föreningen för intracellulär enzyminstruerad självmontering för att bilda nanopartiklarna av intresse och använde nano-CT (nanodatortomografi) för att observera de intracellulära nanopartiklarna.

Den joderade NBC-Jod-CBT småmolekylära strukturen hade en rationell design som bestod av fyra delar, som inkluderade

1. Ett 4-nitrobenxylkarbamat (NBC) substrat för nedbrytning av nitroreduktas (NTR),
2. Ett latent cystein (Cys) motiv och 2-cyano-bensotiazol (CBT) strukturer för CBT-Cys klickkondensationsreaktioner,
3. En joderad region för datortomografi kontrastförbättring, och
4. Två hydrofila asparaginsyramotiv för god vattenlöslighet under fysiologiska tillstånd

När föreningen gick in i nitroreduktas (NTR)-överuttryckande hypoxiska (berövade tillräckliga nivåer av syre) cancerceller, de genomgick självmontering för att bilda nanopartiklar (NP) kända som Iod-CBT-NPs. För att inducera den nitroreduktas-(NTR)-utlösta nanopartikelbildningen i labbet, forskarna inkuberade den lilla molekylen NBC-Iod-CBT med buffrade saltlösningar och tillsatte nitroreduktaslösningen i två timmar för att bilda nanostrukturer med synliga absorbanser mellan 500-700 nm.

När Zhang et al. tillsatt en nitroreduktashämmare känd som dikumarin till lösningen, de synliga absorbanserna av blandningarna minskade, bekräftar bildandet av nanostrukturer i närvaro av nitroreduktas. Med hjälp av transmissionselektronmikroskopbilder, teamet observerade utseendet av nanopartiklar och använde högpresterande vätskekromatografi (HPLC) och högupplöst matrisassisterad laserdesorptions-/joniseringsmasspektrometri för att bekräfta bildandet av jod-CBT-NP. Zhang et al. använde därefter tredimensionella (3-D) nano-CT-bilder av blandningen med en mjuk röntgenmikroskopi nano-CT för att slutligen rekonstruera 3-D nano-CT-bilderna, där olika beståndsdelar av föreningen uppvisade olika röntgenabsorptionsförmåga. På det här sättet, experimentet underlättade NBC-Iod-CBT-föreningen av intresse att genomgå NTR-utlöst självmontering för att bilda de förväntade nanopartiklarna (Iod-CBT-NPs) i labbet.

Intracellulär bildning av jod-CBT-NP och mjuk röntgenmikroskopi nano-CT-avbildning

Zhang et al. sedan undersökte samma experimentella process för att inducera självmontering av nanopartiklar inuti celler. Föreningen av intresse (NBC-Iod-CBT) hade högre selektivitet mot nitroreduktas, för att därigenom förhindra eventuella intracellulära interferenser i närvaro av andra intracellulära beståndsdelar såsom biotioler, oxidanter och aminosyror. De mänskliga HeLa-cancercellerna i livmoderhalsen överuttrycker vanligtvis nitroreduktas (NTR) under hypoxiska förhållanden (berövade på tillräckliga nivåer av syre), nå de högsta experimentnivåerna inom åtta timmar. När Zhang et al. inkuberade hypoxiska HeLa-celler med den lilla molekylen NBC-Iod-CBT, de observerade den slutliga bildandet av nanopartiklar i de hypoxiska HeLa-cellerna. Med hjälp av elektronmikroskopbilder av cellerna, de visade förekomsten av nanopartiklar som förväntat i cellcytoplasman.

För att direkt observera nanopartiklarna av intresse (Iod-CBT-NP) inuti cellerna, teamet experimentellt behandlade de hypoxiska HeLa-cellerna och avbildade dem med hjälp av mjuk röntgenmikroskopi nano-CT. De använde sedan hypoxiska HeLa-celler förbehandlade med dikumarin eller normoxia (normala nivåer av syre) som två positiva kontroller och obehandlade hypoxi- eller normoxi-HeLa-celler som två negativa kontroller. Resultaten indikerade bildandet av Iod-CBT-nanopartiklarna i cytoplasman hos hypoxiska HeLa-celler. När de utsatte dessa celler för behandling med nitroreduktashämmare, CT-kontrasten i cytoplasman minskade. Teamet rekonstruerade 2-D-projektioner av cellerna för att få 3-D nanoCT-bilder. Med hjälp av linjär absorptionskoefficient (LAC) eller linjär dämpningskoefficient, Zhang et al. bekräftade genomförbarheten av intracellulär nanopartikelbildning.

På det här sättet, Miaomiao Zhang och kollegor designade rationellt en joderad liten molekyl NBC-Iod-CBT-konstruktion för att direkt bilda och observera nanopartiklar inuti celler med hjälp av nano-CT. Efter förstahandsexperiment utförda in vitro, teamet genomförde ytterligare studier i cytoplasman hos nitroreduktasuttryckande HeLa-celler. Med hjälp av analytiska tekniker, teamet visade bildning av nanopartiklar (Jod-CBT-NP) i den lilla molekylen NBC-Jod-CBT-behandlade hypoxiska HeLa-cellerna. De verifierade sin metod med hjälp av den linjära absorptionskoefficienten och bekräftade genomförbarheten av intracellulär nanopartikelbildning. Detta arbete kommer att hjälpa forskare att få djupare insikter om bildandet av intracellulära nanostrukturer med betydande tillämpningar inom nanomedicin och bioteknik.

© 2020 Science X Network