Med ett vanligt ljusmikroskop, MIT-ingenjörer har utarbetat en teknik för att avbilda biologiska prover med noggrannhet i en skala av 10 nanometer - som borde göra det möjligt för dem att avbilda virus och potentiellt till och med enstaka biomolekyler, säger forskarna.

Den nya tekniken bygger på expansionsmikroskopi, ett tillvägagångssätt som går ut på att bädda in biologiska prover i en hydrogel och sedan expandera dem innan de avbildas med ett mikroskop. För den senaste versionen av tekniken, forskarna utvecklade en ny typ av hydrogel som bibehåller en mer enhetlig konfiguration, möjliggör större noggrannhet vid avbildning av små strukturer.

Denna grad av noggrannhet kan öppna dörren för att studera de grundläggande molekylära interaktionerna som gör livet möjligt, säger Edward Boyden, Y. Eva Tan professor i neuroteknik, en professor i biologisk teknik och hjärn- och kognitionsvetenskap vid MIT, och medlem av MIT:s McGovern Institute for Brain Research och Koch Institute for Integrative Cancer Research.

"Om du kunde se enskilda molekyler och identifiera vilken typ de är, med ensiffrig nanometer noggrannhet, då kanske du faktiskt kan titta på livets struktur. Och struktur, som ett sekel av modern biologi har berättat för oss, styr funktionen, säger Boyden, som är seniorförfattare till den nya studien.

Tidningens huvudförfattare, som visas idag i Naturen nanoteknik, är MIT-forskaren Ruixuan Gao och Chih-Chieh "Jay" Yu Ph.D. '20. Andra författare inkluderar Linyi Gao Ph.D. '20; tidigare MIT postdoc Kiryl Piatkevich; Rachael Neve, chef för Gene Technology Core vid Massachusetts General Hospital; James Munro, en docent i mikrobiologi och fysiologiska system vid University of Massachusetts Medical School; och Srigokul Upadhyayula, en tidigare biträdande professor i pediatrik vid Harvard Medical School och en biträdande professor i residens för cell- och utvecklingsbiologi vid University of California i Berkeley.

Låg kostnad, hög upplösning

Många labb runt om i världen har börjat använda expansionsmikroskopi sedan Boydens labb först introducerade den 2015. Med denna teknik, forskare förstorar fysiskt sina prover ungefär fyrfaldigt i linjär dimension innan de avbildar dem, så att de kan generera högupplösta bilder utan dyr utrustning. Boydens lab har också utvecklat metoder för att märka proteiner, RNA, och andra molekyler i ett prov så att de kan avbildas efter expansion.

"Hundratals grupper gör expansionsmikroskopi. Det finns helt klart en uppdämd efterfrågan på en enkel, billig metod för nanoavbildning, " säger Boyden. "Nu är frågan, hur bra kan vi bli? Kan vi komma ner till en molekyl noggrannhet? För i slutändan, du vill nå en lösning som går ner till livets grundläggande byggstenar."

Andra tekniker som elektronmikroskopi och superupplöst bildbehandling erbjuder hög upplösning, men den utrustning som krävs är dyr och inte allmänt tillgänglig. Expansionsmikroskopi, dock, möjliggör högupplöst avbildning med ett vanligt ljusmikroskop.

I en tidning från 2017, Boydens labb visade upplösning på cirka 20 nanometer, med hjälp av en process där prover expanderades två gånger före avbildning. Detta tillvägagångssätt, såväl som de tidigare versionerna av expansionsmikroskopi, förlitar sig på en absorberande polymer gjord av natriumpolyakrylat, monteras med en metod som kallas fri radikalsyntes. Dessa geler sväller när de utsätts för vatten; dock, en begränsning av dessa geler är att de inte är helt enhetliga i struktur eller densitet. Denna oregelbundenhet leder till små förvrängningar i formen på provet när det expanderas, begränsar den noggrannhet som kan uppnås.

För att övervinna detta, forskarna utvecklade en ny gel som heter tetra-gel, som bildar en mer förutsägbar struktur. Genom att kombinera tetraedriska PEG-molekyler med tetraedriska natriumpolyakrylater, forskarna kunde skapa en gitterliknande struktur som är mycket mer enhetlig än de friradikalsyntetiserade natriumpolyakrylathydrogelerna de tidigare använde.

Forskarna visade noggrannheten i detta tillvägagångssätt genom att använda det för att expandera partiklar av herpes simplex virus typ 1 (HSV-1), som har en distinkt sfärisk form. Efter att ha expanderat viruspartiklarna, forskarna jämförde formerna med formerna som erhölls med elektronmikroskopi och fann att förvrängningen var lägre än den som sågs med tidigare versioner av expansionsmikroskopi, vilket gör att de kan uppnå en noggrannhet på cirka 10 nanometer.

"Vi kan titta på hur arrangemangen av dessa proteiner förändras när de expanderas och utvärdera hur nära de är den sfäriska formen. Det var så vi validerade det och bestämde hur troget vi kan bevara nanostrukturen hos formerna och de relativa rumsliga arrangemangen av dessa molekyler, " säger Ruixuan Gao.

Enstaka molekyler

Forskarna använde också sin nya hydrogel för att expandera celler, inklusive mänskliga njurceller och mushjärnceller. De arbetar nu på sätt att förbättra noggrannheten till den punkt där de kan avbilda enskilda molekyler i sådana celler. En begränsning av denna grad av noggrannhet är storleken på de antikroppar som används för att märka molekyler i cellen, som är cirka 10 till 20 nanometer långa. För att avbilda enskilda molekyler, forskarna skulle sannolikt behöva skapa mindre etiketter eller lägga till etiketterna efter att expansionen var klar.

De undersöker också om andra typer av polymerer, eller modifierade versioner av tetragelpolymeren, kan hjälpa dem att inse större noggrannhet.

Om de kan uppnå noggrannhet ner till enstaka molekyler, många nya gränser kan utforskas, säger Boyden. Till exempel, forskare kunde se hur olika molekyler interagerar med varandra, som skulle kunna kasta ljus över cellsignalvägar, aktivering av immunsvar, synaptisk kommunikation, läkemedelsmålinteraktioner, och många andra biologiska fenomen.

"Vi skulle gärna titta på regioner i en cell, som synapsen mellan två neuroner, eller andra molekyler involverade i cellcellssignalering, och för att ta reda på hur alla delar talar med varandra, " säger han. "Hur fungerar de tillsammans och hur går de fel i sjukdomar?"