För att bättre förstå grundläggande processer inom livsvetenskap på molekylär nivå är den exakta observationen av enstaka molekylers dynamik av största intresse. Men nuvarande tekniker baserade på fluorescensmätningar i vattenlösningar kan inte spåra förändringar i molekylstruktur med tillräcklig tidsupplösning.
Fysiker vid Max Planck Institute for the Science of Light (MPL) har nu lyckats vidareutveckla en fotonisk struktur känd från kvantoptiken – den plana optiska antennen – för användning i vattenhaltiga medier för att övervaka dynamiska processer. Detta gör att konformationsförändringar av enskilda biomolekyler kan observeras med högsta tidsupplösning.
För att uppnå denna upplösning samlar den så kallade "optofluidiska antennen" fotoner som emitteras av enskilda fluorescerande molekyler med ungefär 85 % effektivitet. Med så hög effektivitet kan forskarna uppnå en tidsupplösning i mikrosekundersintervallet. Enheten kan enkelt integreras i många befintliga mikroskopiinställningar och lägger till ytterligare ett verktyg som ger en hög tidsupplösning i laboratoriet.
Att studera den komplicerade interna dynamiken hos biomolekyler i en flytande miljö med en molekylupplösning är av stort intresse för biovetenskaperna.
Fluorescensmätningar är för närvarande hörnstenstekniken för att dechiffrera snabba och långsamma dynamiska processer. Här är speciella delar av biomolekylerna märkta med fluorescerande färgämnesmolekyler. När de exciteras med laserljus detekteras förändringar i deras position i förhållande till varandra genom att mäta de emitterade fotonerna. Insamlingsmetoden begränsar dock antalet fluorescensfotoner som kan registreras per tidsintervall, vilket begränsar den tidsmässiga upplösningen.
I arbetet, publicerat i Nature Communications , visar teamet under ledning av professor Stephan Götzinger och professor Vahid Sandoghdar en helt ny, högeffektiv mätmetod som är baserad på strukturer kända från solid-state kvantoptik.
Fysiker utvecklade konceptet med den plana optiska antennen för ungefär 10 år sedan och i motsats till konventionella optiska antenner kan en plan antenn realiseras utan metalliska nanostrukturer. Genom en smart modifiering kan de nya optofluidiska antennerna samla in fotoner som emitteras av en enda biomolekyl i lösning med extremt hög effektivitet (85%).
Antennen består av ett glassubstrat och ett flera hundra nanometer tjockt vattenlager innehållande de biomolekyler som ska undersökas. Det tunna lagret av vatten skapas av en mikropipett placerad bara några hundra nanometer ovanför substratet. Genom att applicera ett definierat tryck kontrolleras formen på vattenmenisken i pipetten.
Vattenskiktets axiella gräns tvingar molekylerna att diffundera genom laserfokusets centrum och ökar därmed den så kallade ljusstyrkan. Antennen ökar fluorescenssignalen för molekylerna ungefär fem gånger. Samtidigt bromsar vatten-luft-gränssnittet diffusionen av molekyler, medan antenngeometrin ökar sannolikheten för att en molekyl återgår till fokus.
MPL-forskarna demonstrerar prestandan hos den optofluidiska antennen tillsammans med gruppen av professor Claus Seidel, universitetet i Düsseldorf, genom att undersöka förändringen i överensstämmelse hos ett specifikt arrangerat DNA – DNA-fyrvägsövergången.
Två av korsningens ben är markerade med ett Förster resonansenergiöverföringspar (FRET), där antalet fotoner som emitteras av var och en av de två FRET-partnerna ändras med avståndet mellan de två benen. Med hjälp av FRET-banor kunde forskarna bevisa att ett misstänkt konformationstillstånd inte inträffar och ge en övre gräns för dess livslängd. Den nya antennen kan spåra dynamiken i DNA-korsning i fyra riktningar med en tidsupplösning på bara några mikrosekunder.
"Vår optofluidantenn fungerar så bra tack vare den förbättrade fotonuppsamlingseffektiviteten från långsammare spridande molekyler i den spatialt begränsade kanalen", säger professor Stephan Götzinger.
"Antennen är en kraftfull anordning för undersökningar inom biovetenskap. Den är inte bara lätt att använda, utan kan också enkelt integreras i många befintliga mikroskopiuppsättningar", tillägger professor Vahid Sandoghdar.
Mer information: Luis Morales-Inostroza et al, En optofluidisk antenn för att förbättra känsligheten för ensändarmätningar, Nature Communications (2024). DOI:10.1038/s41467-024-46730-w
Journalinformation: Nature Communications
Tillhandahålls av Max Planck Institute for the Science of Light
