Molekylär design och syntes av rekombinant polypeptid RCPhC1. (a) Peptidsekvensen för RCPhC1 visar Gly-Xaa-Yaa upprepas med aminosyrasubstitutioner (röd). Alla peptidfragment (minimipentasekvenser) innehållande aminosyrasubstitutionerna (dubbelhuvudpilar) matchades med humana kollagensekvenser. (b) Genomisk DNA -stabilitet i den fungerande cellbanken. Efter var och en av fyra på varandra följande fragmenteringar, genomiskt DNA isolerades (spår 1–4) och jämfördes med det ursprungliga genomiska DNA (spår 5). Den högra panelen, Southern blot hybridiserade med AOX1 -promotorsonden. (c) Reproducerbarhet analyserades med vätskekromatografi. Omvändfasprofilen visade tre toppar, som konsekvent identifierades i tre olika satser (H2, K3, och jag). (d) Reproducerbarhet utvärderades också med SDA-PAGE. Det enda bandet med tre olika satser föreslog också frånvaron av posttranslationell modifiering. (e) Frånvaron av posttranslationell glykosylering. (f) Gelpermeationskromatografi bekräftade RCPhC1:s höga renhet. Upphovsman:Nature Communications Materials, doi:10.1038/s43246-020-00089-9
Den nuvarande guldstandarden för bentransplantation inkluderar autotransplantationer och allografter, även om det finns en växande efterfrågan på att utveckla syntetiska biomaterial för förbättrad biointegration inom benvävnadsteknik. I en ny rapport som nu publicerats den Naturkommunikationsmaterial , Hideo Fushimi och ett forskargrupp inom biovetenskap och teknik, och rekonstruktiv bioteknik i Japan och USA, utvecklat ett biologiskt nedbrytbart ställningsmaterial med rekombinanta proteiner eller polypeptider som källa till hydrogelbaserade ympmaterial. Teamet använde mänsklig typ I kollagen alfa 1 -kedja (förkortad RCPhC1) som källa för att utveckla den rekombinanta polypeptiden och visade flexibiliteten hos materialet för att konstruera idealiska egenskaper för bentransplantat. Teamet utvecklade också RCPhC1 -bentransplantat med en mycket skalbar, effektiviserat produktionsprotokoll för den robusta generationen av mogen benvävnad i labbet. Bentransplantatet resorberades helt efter vävnadsregenerering i en preklinisk djurmodell för effektiv biologisk integration.
Benvävnadsteknik med biomimetik, syntetiska bentransplantat
I det här arbetet, Fushimi et al. utvecklat ett syntetiskt bentransplantatmaterial genom att använda ett rekombinant protein förkortat RCPhC1. Utvecklingen ger ett mångsidigt källmaterial för att tillverka syntetiska bentransplantat via flexibel konstruktion. Använda prekliniska studier på modeller med hunddefekter och gnagare, laget visade förbättrad effektivitet hos bentransplantaten för att regenerera benvävnad med strukturell mognad. Inom klinisk ortopedi, förlust av vävnadsvolym och funktion är ett kännetecken för skada, kronisk inflammation, och metabolisk och genetisk sjukdom. Medan benvävnad aktivt kan regenerera via proliferation och osteogen differentiering av mesenkymala stromala eller stamceller, stora benfel kräver kirurgiska ingrepp för att reparera och bygga om ben med benmaterial.
Globalt sett ortopedkirurger utför cirka 2,2 miljoner bentransplantationer årligen på en mycket dyr global marknad. Mänsklig benvävnad består av organisk extracellulär matris, kristalliserat kalcium och fosformineraler som bildar hydroxiapatit. Bentransplantatmaterial kan efterlikna strukturen och den biokemiska sammansättningen av benvävnad. Ortopedkirurger och forskare har använt autologa bentransplantat (celler och vävnad från samma individ) för att reparera skada på grund av mineraliska och immunologiska problem, även om komplikationer på operationsplatserna kan leda till alternativa ympningsmetoder såsom allotransplantat (celler och vävnad erhållen från en annan individ). Den nyare utvecklingen av biomimetik, syntetiska biomaterial för benvävnadsteknik tar itu med ett akut behov inom hälso- och sjukvårdsindustrin att utveckla nya transplantatmaterial utan att använda vävnad från människor eller djur.
Tekniska kontrollfaktorer för att utveckla isotropa ismallade strukturer genom tunnskiktad frysgjutning (TLFC). (a) Diagram över apparater för frysgjutning. (b) Typisk temperaturmätning av kylskålens botten (blå) och den lösta ytan (röd) under frysgjutningen. Det fanns en signifikant skillnad mellan kylkoppen och den lösta ytan under frysperioden. (c) Diagram över anisotropisk ismallad struktur och den faktiska RCPhC1-mikrostrukturen som innehåller den lilla porzonen. Skala bar motsvarar 500 μm. d TLFC minskade temperaturskillnaden mellan kylkoppen (blå) och den lösta ytan (röd) under frysperioden. (e) Effekten av minsta temperatur och kylningstid på den isotropa inre porstrukturen. Den enhetliga porstrukturen (blå) utvecklades när minimitemperaturen var under −10 ° C men påverkades inte av kyltiden. Den oregelbundna inre porstrukturen (röd) utvecklades oftare när minimitemperaturen var över −10 ° C. Skala bar motsvarar 500 μm. Grönt område visar antalet jämnt frystorkade kakor. Rött område visar antalet oregelbundet frystorkade kakor. (f) Blocktemperaturens effekt på den inre porstorleken. Diamanter visar medianvärden. De lägre blocktemperaturerna ökade antalet små porer. Skala bar motsvarar 500 μm. (g) Den inre strukturen som utvecklats genom omrörning (röda cirklar), anisotropa (gröna cirklar) och isotropa (blå cirklar) frysgjutningsmetoder utvärderades genom vattenabsorption och syra -sönderdelningsanalyser. RCPhC1 -svampar tvärbindades preliminärt vid 130 ° C i 7 timmar. Blå linjer i panelerna b och d indikerar temperaturregistret från termoelementet i botten av lösningarna. Röda linjer indikerar det vid lösningsytan. Upphovsman:Nature Communications Materials, doi:10.1038/s43246-020-00089-9 
Teamet använde kollagen av typ I, uttrycks rikligt i bindväv och interstitiella membran som en viktig organisk komponent i benvävnad. Proteinsekvensen av kollagen av typ I spelar en viktig roll för att fastställa benets mekaniska styrka. Teamet klonade först kompletterande DNA (cDNA) - en DNA -kopia av en messenger RNA (mRNA) molekyl som kodar för polypeptiden (proteinsekvensen) RCPhC1, till en uttrycksvektor. För att åstadkomma detta, de använde en metylotrof jästart som kallas Pichia pastoris för att överföra sekvensen och generera master- och fungerande cellbanker. Teamet bekräftade aminosyrasammansättningen för den syntetiska polypeptiden och karakteriserade produkten i stor utsträckning.
De konstruerade sedan den inre strukturen för transplantatmaterialet för att uppfylla specifika krav för målvävnaden. För att skapa en enhetlig porstruktur, därför, Fushimi et al. designat ett tunnskiktat frysgjutningsprotokoll (TLFC). Den mångsidiga frysmetoden genererade ett stort antal porer med tunna väggar för att bilda en isotrop RCPhC1 -ställning med olika inre strukturer.
Tekniska faktorer som påverkar dehydrotermisk tvärbindning av RCPhC1 för att kontrollera biologisk nedbrytningshastighet och mekanisk hållfasthet. (a) Effekten av tvärbindningstemperatur och tvärbindningstid på biologisk nedbrytningshastighet utvärderad genom sönderdelningsanalys in vitro syra. (b) Tvärbindningstemperaturen påverkade inte linjärt syraupplösningsöverlevnadshastigheten linjärt. Med tanke på steriliseringen nedströms, tvärbindningstemperaturen sattes till 130 ° C. (c) Tvärlänkningstiden befanns vara den dominerande kontrollfaktorn, vilket linjärt ökade sura sönderdelningsöverlevnadshastigheten för RCPhC1 upp till 10 timmar. Svingelatinmaterial svarade på samma sätt som tvärbindningstiden, fast det kräver mycket längre tid. (d) Fysisk egenskap hos dehydrotermisk tvärbunden RCPhC1. Motsvarande fysikaliska egenskap hos dehydrotermiskt tvärbundet svingelatin krävde 10 gånger längre tvärbindningstid. (e) Den mekaniska hållfastheten för dehydrotermisk tvärbunden RCPhC1 (130 ° C, 7 h) var signifikant högre än för dehydrotermiskt tvärbundet svingelatin (130 ° C, 72 timmar). Felfältet representerar s.d. (f) Dehydrotermisk tvärbunden RCPhC1 (130 ° C, 7 h) behandlades med trypsin och utsattes för högpresterande LC. Samvandring av peptidfragment indikerade flera tvärbindningsställen. Upphovsman:Nature Communications Materials, doi:10.1038/s43246-020-00089-9 
Fushimi et al. därefter utsattes materialet för dehydrotermisk tvärbindningsbehandling för att testa effekten av tvärbindningstemperatur och varaktighet på dess sammansättning. Efter att ha testat nedströms produkten för mikrobiell kontaminering, temperaturen under tillverkningsprocessen bekräftades vara effektiv för torr värmesterilisering. Ytterligare test visade hur den unika aminosyrasammansättningen för det rekombinanta proteinet bidrog till dess robusta hydrotermiska tvärbindningseffektivitet. Teamet optimerade därefter det rekombinanta proteinmaterialet för bentransplantation genom att reglera koncentrationen av polypeptidmaterialet och dess frysningstemperatur baserat på volymen av transplantatinducerat ben i en råttkalvarial (skalle) bendefektmodell. Fyra veckor efter ympning av materialet i djurmodellen, laget använde mikroberäknad tomografi (mikro-CT) -baserad benvolymberäkning. Resultaten indikerade en optimal koncentration på 7,5 procent RCPhC1, en frysningstemperatur på -40 till -60 grader Celsius, och dehydrotermisk tvärbindning vid 130 ° C i 7 timmar för att vara bäst lämpad för tillverkning av rekombinant bentransplantat.
Optimering av tekniska kontrollfaktorer. (a) Optimering av kombinerade faktorer för RCPhC1 -lösningskoncentration och TLFC -blocktemperatur, med den preliminära dehydrotermiska tvärbindningen vid 130 ° C i 7 timmar. Det optimala intervallet minskades till RCPhC1 -koncentration mellan 7,5 och 9% och TLFC -blocktemperatur mellan −40 och −60 ° C (rött prickat block). (b) BV/TV -mätningar inom gruppen av det optimala intervallet för RCP1C1 -koncentration och kyltemperatur. Det fanns ingen statistisk skillnad mellan grupperna. (c) Effekten av RCPhC1 löst koncentration på benregenerering. Skala bar motsvarar 500 μm. (d) Effekten av TLFC -blocktemperatur på benregenerering. Skala bar motsvarar 500 μm. (e) Effekten av dehydrotermisk tvärbindningstid på benbildning. (n =7; Tukey’s multipeljämförelsetest) (f). Effekten av dehydrotermisk tvärbindningstid på bibehållandet av sårläkningsutrymme i råttkalvarialbendefekt. Vita pilspetsar visar defekta kanter. Vita prickade linjer cirklar nybildad vävnad. Skala bar motsvarar 500 μm. Horisontella linjer i b, och e representerar medelvärde ± s.d. Upphovsman:Nature Communications Materials, doi:10.1038/s43246-020-00089-9
Robust regenerering av vital benvävnad i prekliniska modeller med transplantatmaterial
Baserat på de experimentellt verifierade optimala förhållandena, Fushimi et al. tillverkade RCPhC1 -bentransplantat med porösa granulat. Med hjälp av råttkalvarialbendefektmodell, de visade hur bentransplantatet robust inducerade benregenerering inom den inre porstrukturen, medan du gradvis försämrar in vivo, för att indikera biokompatibilitet och effektiv biointegration. De jämförde detta resultat med ett kommersiellt tillgängligt nötkreatur (ko) decellularized cancellous xenograft och observerade inte signifikant större benregenerering. Teamet testade sedan bentransplantatmaterialet i en preklinisk modell för tanduttag för att förstå sårläkning i tandhylsan, där extraktionshylsan behandlad med bentransplantatet visade förbättrad benbildning efter 12 veckor. Vid denna tid, som förväntat, bentransplantatet ersattes till stor del av benvävnad.
Prekliniskt effektprov av RCPhC1 -materialet optimerat för bentransplantat hos gnagare och hundmodeller. (a) Flödesschema för tillverkningsprocessen för RCPhC1 -bentransplantat. Skala bar motsvarar 100 μm. (b) RCPhC1 -bentransplantat framställdes som porösa granuler av storlek 300–1200 µm för bättre hantering. Skala bar motsvarar 100 μm. (c) Tidsförloppet för benregenerering inducerad av RCPhC1 -bentransplantation i råttkalvarialdefektmodellen. Histologisk analys (översta raden) avslöjade nybildad benvävnad (B) i RCPhC1 -transplantatmaterial, som resorberades med tiden. En tidskursserie av in vivo microCT (nedre raden) skildrade den progressiva ökningen av benvävnad. (d) Tidsförlopp för BV/TV -mätning av råttkalvarialbendefekt implanterad med RCPhC1 -bentransplantat, bovint decellularized cancellous benxenotransplantat och ingen transplantatkontroll. (e) Histologisk utvärdering av xenotransplantat av nötkreatur implanterat i råttkalvarialbendefekt. Den fysiska strukturen för nötkreatur av xenotransplantat liknade den för RCPhC1 -bentransplantat. I utkanten av defekten, bovint xenotransplantat sågs fusionerat till det nybildade benet (B). I mitten av defekten, bovint xenotransplantatgranulat omgavs av fibrös vävnad. Skala bar motsvarar 200 μm. (f) Hundtanduttagsmodell. Hundens tredje premolär (P3) har nästan identiska mesiala och distala rötter. Den tredje premolaren hemisektionerades och endast den distala roten extraherades. Ena sidan av benuttaget efter extraktion fylldes med RCPhC1 medan den andra fick lämnas att läka utan ytterligare behandling. Den återstående medialroten behandlades endodontiskt och fungerade som referens. Skalstång är 4 mm. (g) MicroCT-tvärsnitt som visar benregenerering i extraktionsuttaget (vit linje) efter 12 veckors (12 W) läkning. Benvolymen i sockeln var signifikant större i RCPhC1-implantat för implantat än den obehandlade kontrollhylsan (n =8; dubbelsidigt parat t-test). Skalstång är 4 mm. (h) Histologiskt tvärsnitt av extraktionsuttaget (vit linje) vid 12 W. Sockeln som mottog RCPhC1 -bentransplantation uppvisade större benregenerering. Prickade vita linjer visar kontaktgränssnitt. Skalstång är 1 mm. (i) Histologisk utvärdering av RCPhC1 -bentransplantation (I) associerad benregenerering. Riklig vaskulär bildning (II) i benmärgsvävnaden noterades för regenererande ben (III) efter 4 veckors (4 W) läkning. RCPhC1 -bentransplantat resorberades till stor del efter 12 W läkning. Det regenererade benet innehöll vitala osteocyter (IV). Upphovsman:Nature Communications Materials, doi:10.1038/s43246-020-00089-9
Utsikter över syntetiska byggnadsställningar inom benvävnadsteknik
På det här sättet, Hideo Fushimi och kollegor optimerade en enkel, men kritisk konstruktionsprocess för att reglera koncentrationen av lösta ämnen för en rekombinant polypeptid av humant typ I -kollagen -alfa I -kedjeprotein med riktade aminosyrasubstitutioner, förkortas som RCPhC1. Teamet implanterade först konstruktionen i en råttkalvarialbendefektmodell för att förstå de optimala tekniska faktorerna för att tillverka bentransplantatet. De utformade bentransplantatmaterialet för att stödja migrationen av mesenkymala stamceller (MSC) mot defektområdet och gav en stimulerande mikromiljö för osteogen differentiering. Benmaterialet ensamt visade ett idealiskt läkningsmönster i frånvaro av tillväxtfaktorer och stamceller för att regenerera ben. Materialet kan användas för att generera vävnadsspecifika medicintekniska produkter och transplantatställningar med betydande tillverkningsmässig mångsidighet inom benvävnadsteknik.
© 2020 Science X Network
