Parasiter med en markör för PP1 tar över en värdcell. Kredit:Alice Herneisen/Whitehead Institute
Ungefär som människor, växter och bakterier använder den encelliga parasiten Toxoplasma gondii (T. gondii) kalcium som budbärare för att koordinera viktiga cellulära processer. Men medan budbäraren är densamma, skiljer sig kommunikationsvägarna som bildas runt kalcium avsevärt mellan organismer.
"Eftersom Toxoplasma-parasiter skiljer sig så mycket från oss, har de utvecklat sina egna uppsättningar av proteiner som är involverade i kalciumsignalvägar", säger Alice Herneisen, doktorand i labbet av Whitehead Institute-medlem Sebastian Lourido.
Lourido och hans labb studerar de molekylära mekanismerna som gör att den encelliga parasiten T. gondii och relaterade patogener är så utbredda och potentiellt dödliga – och kalciumsignalering är en viktig del av parasitens process att invadera dess värdar. "Kalcium styr denna mycket viktiga övergång från parasiter som replikerar inuti värdceller till parasiter som lämnar dessa celler och letar efter nya att infektera," sa Lourido. "Vi har verkligen varit intresserade av hur kalcium spelar in i regleringen av proteiner inuti parasiten."
En tidning publicerad 17 augusti i eLife ger en viss insikt. I artikeln använde Herneisen, Lourido och medarbetare ett tillvägagångssätt som kallas termisk profilering för att i stora drag kartlägga vilka parasitproteiner som är involverade i kalciumsignalering i T. gondii. Det nya arbetet avslöjar att ett oväntat protein spelar en roll i parasitens kalciumvägar och ger nya mål som forskare potentiellt kan använda för att stoppa spridningen av parasiten. Data kommer också att fungera som en resurs som andra Toxoplasma-forskare kan använda för att ta reda på om deras egna proteiner av intresse interagerar med kalciumvägar i parasitceller.
Värmen är på
När man studerar kalciumvägar hos människor kan forskare ofta dra paralleller från arbete med möss. "Men parasiter är väldigt olika oss," sa Lourido. "Alla principer som vi har lärt oss om kalciumsignalering hos människor eller möss kan inte lätt översättas till parasiter."
Så för att studera dessa mekanismer i Toxoplasma var forskarna tvungna att börja från början för att avgöra vilka proteiner som var inblandade. Det var där den termiska profileringsmetoden kom in. Metoden bygger på observationen att proteiner är designade för att fungera bra vid specifika temperaturer, och när det blir för varmt för dem smälter de. Tänk på ägg:när proteinerna i äggvita och äggulor värms upp i en stekpanna börjar proteinerna smälta och stelna. "När vi tänker på ett protein som smälter, menar vi att proteinerna löser sig", sa Lourido. "När proteiner rivs upp, exponerar de sidokedjor som binder till varandra. De slutar vara individuella proteiner som är välvikta och blir ett nät."
Små förändringar i den kemiska strukturen hos ett protein - som förändringar som är resultatet av bindning av en liten molekyl som kalcium - kan ändra smältpunkten för ett protein. Forskare kan sedan spåra dessa förändringar med hjälp av proteomiska metoder. "Proteiner som binder kalcium förändras som svar på kalcium och ändrar i slutändan deras termiska stabilitet," sa Herneisen. "Det är typ språket för proteiner, förändringar i deras termiska stabilitet."
Den termiska profileringsmetoden fungerar genom att applicera värme på parasitceller och grafisera hur var och en av parasitens proteiner reagerar på förändringar i temperatur under olika förhållanden (till exempel närvaro eller frånvaro av kalcium). I en artikel från 2020 använde forskarna den termiska profileringsmetoden för att undersöka rollen av ett protein som kallas ENH1 i kalciumsignalering.
I sin nya artikel undersökte Lourido och Herneisen effekten av kalcium på alla proteiner i parasiten med två metoder. Forskarna kombinerade parasiter med specifika mängder kalcium, applicerad värme och utförde sedan proteomiktekniker för att spåra hur kalciumet påverkade smältbeteendet för varje protein. Om ett proteins smältpunkt var högre eller lägre än vanligt, kunde forskarna dra slutsatsen att det proteinet ändrades antingen av kalcium självt eller av en annan spelare i en kalciumsignalväg.
De behandlade sedan parasiterna med en kemikalie som fick dem att frigöra lagrat kalcium på ett kontrollerat sätt och mätte hur en proteinmodifiering som kallas fosforylering förändrades över tiden. Tillsammans gjorde dessa metoder det möjligt för dem att sluta sig till hur proteiner kan känna av och svara på kalcium inom signalnätverket.
Deras tillvägagångssätt gav data om nästan alla uttryckta proteiner i parasitcellerna, men forskarna nollställde ett visst protein som heter Protein Phosphatase 1 (eller PP1). Proteinet finns överallt i många arter, men har aldrig tidigare varit inblandat i kalciumsignaleringsvägar. De fann att proteinet var koncentrerat vid parasitens främre ände. Denna region av parasitcellen är involverad i motilitet och värdinvasion.
Proteinets roll i parasiterna – och i de andra organismerna där det förekommer – är att ta bort de små molekylerna som kallas fosfater från fosforylerade proteiner. "Detta är en modifiering som ofta kan förändra aktiviteten hos enskilda proteiner, eftersom det är den här stora laddningen som har fastnat kovalent på ytan av proteinet," sa Lourido. "Detta blir en princip genom vilken många, många olika biologiska processer regleras."
Hur exakt PP1 interagerar med kalcium återstår att se. När forskarna tömde PP1 i parasitceller fann de att proteinet på något sätt är involverat i att hjälpa parasiten att ta i sig kalcium som är nödvändigt för rörelse. Det är oklart om det faktiskt binder kalcium eller inte är involverat i vägen genom en annan mekanism.
Eftersom parasiter använder kalciumsignalering för att koordinera livscykelförändringar som att komma in i eller lämna värdceller, kan insikter om nyckelaktörerna i kalciumvägar vara en välsignelse för folkhälsan. "Detta är typ av tryckpunkter eller nav som skulle vara idealiska att rikta in sig på för att förhindra spridning och patogenes av dessa parasiter," sa Herneisen.
Herneisen och medarbetare fokuserade främst på PP1, men det finns många andra proteiner att undersöka med hjälp av data från detta projekt. "I think part of the reason why I wanted to release this paper is so that the field could take the next steps," she said. "I'm just one person—it would be great if 20 other people find that the protein that they were studying is calcium responsive, and they can chase down the exact reason for that or how it is involved in this greater calcium signaling network. This was exciting for us with regards to PP1, and I'm sure other researchers will make their own connections." + Utforska vidare
