Gram-fläcken är en differentiell färgningsprocedur som visar vilka bakterier som är Gram-positiva eller Gram-negativa baserat på deras färgfärg. Acetonalkohol är ett reagens som används i denna process för att ge färgdifferentiering. Gram-positiva bakterier har ett tjockt peptidoglykansk skikt och fläckar lila, medan gram-negativa mikroorganismer har lite till inget peptidoglykansk skikt och rosa färger. beredd används kristallviolett för att först färga provet. Vid denna punkt kommer både Gram-positiva och Gram-negativa bakterier att visas lila. Vanligtvis appliceras kristallfiolett på objektglaset i 30 sekunder innan du tvättar bort överflödigt fläck med vatten. Kristallviolet kan vidhäfta lite till peptidoglykanlagren så att inte all primärfärg kommer att tvättas bort med vattnet. Mordant-Jod

Jod tillsättes sedan till provet under en minut. Det fungerar som en mordant, som tjänar till att fixa färgämnen i en färgningsprocess. Jod utför denna funktion genom att binda till kristallvioletten och skapa ett olösligt komplex som vidhäftar mycket bättre det tjocka peptidoglykanskiktet som finns i Gram-positiva bakterieceller än bara kristallvioleten. Det finns inte ett tvättsteg med vatten efter tillsats av jod.
Avfärgningsmedel - Alkohol

Antingen kan aceton eller etylalkohol användas som avfärgningsmedel. Alkoholen löser upp lipider som finns i det yttre cellmembranet av gramnegativa bakterier, vilket gör att kristallviolett jodkomplexet läcker ut ur det tunnare peptidoglykanskiktet. Alkoholen tillsätts under 10 till 20 sekunder; den hälls på objektglaset tills all jod har tvättats bort och avströmningen är färglös. Vid denna punkt i Gram-fläckprocessen är Gram-negativa bakterier färglösa medan Gram-positiva bakterier fortfarande behåller kristallviolet. När bilden är klar måste den sköljas med vatten för att stoppa avfärgningseffekten.
Counterstain-Safranin