NADH produceras i citronsyracykeln, som är en serie kemiska reaktioner som omvandlar glukos till koldioxid och vatten. Under citronsyracykeln bildas NADH när två väteatomer överförs från en molekyl av glukos till en molekyl av NAD+ (nikotinamidadenindinukleotid).
Elektronerna som bärs av NADH används sedan för att generera ATP genom oxidativ fosforylering, vilket är en process som äger rum i mitokondrierna. Under oxidativ fosforylering överförs elektronerna från NADH till syre genom en serie elektronbärare. När elektronerna rör sig genom elektronbärarna frigör de energi som används för att pumpa vätejoner över mitokondriella membranet. Vätejonerna strömmar sedan tillbaka genom membranet genom ATP-syntas, ett enzym som omvandlar ADP till ATP.
NADH är också involverad i andra cellulära processer, såsom DNA-replikation och reparation, och syntesen av lipider och steroider.