1. Proteinextraktion och beredning:
– Det första steget är att extrahera proteiner från provet av intresse. Detta kan göras med olika metoder, såsom celllys eller vävnadshomogenisering, följt av centrifugering för att avlägsna cellrester.
- De extraherade proteinerna kvantifieras sedan, vanligtvis med en Bradford-analys eller liknande metoder, för att säkerställa lika proteinbelastning i efterföljande steg.
2. Proteinseparation:
- Proteinprovet blandas med en laddningsbuffert innehållande ett reduktionsmedel (t.ex. beta-merkaptoetanol eller DTT) och ett spårningsfärgämne (t.ex. bromfenolblått).
- Proteinblandningen laddas på en polyakrylamidgel för elektrofores. Gelen utsätts för en elektrisk ström, vilket gör att proteinerna separeras beroende på deras storlek. Mindre proteiner migrerar snabbare genom gelén, medan större proteiner rör sig långsammare.
3. Proteinöverföring:
- Efter elektrofores överförs de separerade proteinerna från gelén till ett nitrocellulosamembran eller polyvinylidendifluorid (PVDF) membran. Denna process, känd som proteinblotting eller elektroblotting, innebär att gelén och membranet placeras i en överföringsbuffert och att en elektrisk ström appliceras.
- Som ett resultat överförs proteinerna från gelén till membranet, vilket skapar en kopia av de separerade proteinerna.
4. Membranblockering:
- För att minska ospecifik bindning av antikroppar blockeras nitrocellulosa- eller PVDF-membranet med en lösning som innehåller ett protein såsom bovint serumalbumin (BSA) eller fettfri torrmjölk.
- Detta blockeringssteg hjälper till att minimera bakgrundssignaler och förbättrar specificiteten för antikroppsbindning under de efterföljande stegen.
5. Primär antikroppsinkubation:
- Membranet inkuberas med en primär antikropp som specifikt känner igen och binder till proteinet av intresse. Primära antikroppar genereras typiskt mot målproteinet eller en specifik epitop i proteinet.
- Dessa antikroppar späds ut i en lämplig buffert och inkuberas med membranet, vilket gör att de kan binda till sina målproteiner.
6. Tvätt:
- Efter den primära antikroppsinkubationen tvättas membranet noggrant för att avlägsna obundna antikroppar och minska bakgrundssignaler. Detta tvättsteg är avgörande för att säkerställa specifik detektering av målproteinet.
7. Sekundär antikroppsinkubation (konjugerad med ett reporterenzym):
- En sekundär antikropp, konjugerad till ett enzym som pepparrotsperoxidas (HRP) eller alkaliskt fosfatas (ALP), används för att detektera de primära antikropp-antigenkomplexen på membranet.
- Sekundära antikroppar är artspecifika, vilket innebär att de känner igen och binder till de primära antikroppar som produceras i en viss art (t.ex. mus eller kanin).
- Den enzymkonjugerade sekundära antikroppen binder till den primära antikroppen, vilket skapar ett komplex som möjliggör signalförstärkning och visualisering.
8. Tvätt:
– Ytterligare ett tvättsteg utförs för att ta bort obundna sekundära antikroppar och minska bakgrundssignaler.
9. Kemiluminescensdetektion:
- För HRP-konjugerade sekundära antikroppar tillsätts ett kemiluminescerande substrat till membranet. När substratet reagerar med HRP avger det ljus.
- Specialiserade kemiluminescensdetektionssystem eller röntgenfilmer används för att fånga och visualisera de emitterade ljussignalerna. Ljusets intensitet motsvarar mängden målprotein som finns i provet.
10. Dataanalys och tolkning:
- Den framkallade röntgenfilmen eller digitala kemiluminescensbilderna analyseras för att identifiera band eller fläckar som motsvarar målproteinet.
- Storleken och intensiteten av dessa band kan ge information om molekylvikten, förekomsten och post-translationella modifieringar av det detekterade proteinet.
Genom att följa dessa steg möjliggör western blotting specifik detektion och analys av ett protein av intresse i en komplex blandning av proteiner. Det används i stor utsträckning inom olika områden av biologisk forskning, inklusive molekylärbiologi, immunologi och klinisk diagnostik.
