Detta protokoll beskriver en grundläggande metod för att extrahera genomiskt DNA från jordnötblad med en enkel och kostnadseffektiv metod.
Material:
* Jordnötslöv (färskt eller fryst)
* Flytande kväve
* Murbruk och stöt
* 1,5 ml mikrocentrifugrör
* 100 mM Tris-HCl (pH 8,0)
* 25 mm EDTA (pH 8,0)
* 1,4 M NaCl
* 10% SDS (natriumdodecylsulfat)
* Kloroform:Isoamylalkohol (24:1)
* Isopropanol
* 70% etanol
* RNase en lösning (10 mg/ml)
* Spektrofotometer
Förfarande:
1. provberedning:
* Samla färska eller frysta jordnötblad. Om du använder frysta blad tina dem vid rumstemperatur.
* Väg ungefär 0,1-0,2 g bladvävnad.
* Placera bladen i en förkyld murbruk och slip dem till ett fint pulver med flytande kväve.
2. lysis:
* Överför de pulveriserade bladen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
* Tillsätt 500 | il lysbuffert (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 25 mM EDTA, pH 8,0, 1,4 M NaCl och 10% SDS).
* Inkubera röret vid 65 ° C i 30 minuter med tillfällig skonsam skakning. Detta steg bryter ner cellväggarna och membranen och släpper DNA.
3. Proteinborttagning:
* Tillsätt 200 | il kloroform:isoamylalkohol (24:1) i röret.
* Skaka röret kraftigt i 10 minuter.
* Centrifugera röret vid 10 000 x g under 10 minuter vid rumstemperatur. Detta steg separerar lösningen i tre skikt:vattenhaltigt skikt (överst), interfas (mitten) och organiskt skikt (botten). DNA är i det vattenhaltiga skiktet.
4. DNA -utfällning:
* Överför det vattenhaltiga skiktet till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
* Tillsätt 0,5 volym isopropanol i röret och blanda försiktigt. Detta kommer att fälla ut DNA ur lösningen.
* Inkubera röret vid -20 ° C i 30 minuter.
* Centrifugera röret vid 10 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. DNA -pelleten bildas längst ner i röret.
5. tvätt och torkning:
* Ta bort supernatanten och tvätta DNA -pelleten med 500 | il 70% etanol.
* Centrifugera röret vid 10 000 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
* Ta bort etanolen och lufttorka pelleten i 5-10 minuter.
6. Resuspension och RNase -behandling:
* Återsuspendera DNA-pelleten i 50 | il TE-buffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0).
* Tillsätt 1 | il RNase en lösning (10 mg/ml) i röret.
* Inkubera röret vid 37 ° C under 30 minuter för att avlägsna eventuellt återstående RNA.
7. DNA -kvantifiering och kvalitetskontroll:
* Kvantifiera det extraherade DNA med användning av en spektrofotometer vid 260 nm och 280 nm våglängder. Förhållandet mellan absorbans vid 260 nm/280 nm bör vara mellan 1,8 och 2,0, vilket indikerar rent DNA.
Anmärkningar:
* Detta protokoll är en grundläggande riktlinje och kan behöva anpassas baserat på det specifika bladmaterialet och önskad kvalitet på DNA.
* Bär alltid handskar och labbrockar när du hanterar biologiska prover.
* Se till att alla reagens och utrustning är sterila för att undvika förorening.
* Du kan också använda kommersiella DNA -extraktionssatser för en mer strömlinjeformad och effektiv process.
Ytterligare applikationer:
* Det isolerade genomiska DNA kan användas för olika molekylära biologiska tillämpningar, inklusive:
* PCR (polymeraskedjereaktion)
* DNA -sekvensering
* Genetisk analys
* Kloning
Detta protokoll tillhandahåller en enkel och kostnadseffektiv metod för att isolera genomiskt DNA från jordnötter och banar väg för olika forskning och tillämpningar.
