Ett genomiskt bibliotek är en samling klonade DNA -fragment som representerar hela genomet av en organisme. Det är som en uppsättning instruktioner, som innehåller all den genetiska information som behövs för att bygga och upprätthålla den organismen. Så här produceras det:
1. DNA -extraktion:
* Isolat genomiskt DNA: Detta handlar om att bryta öppna celler och extrahera DNA med olika tekniker som enzymatisk matsmältning och rening.
2. DNA -fragmentering:
* Skär DNA i hanterbara bitar: Genomiskt DNA är för stort för att klonas direkt. Den måste fragmenteras i mindre bitar, vanligtvis 10-20 kb lång, med hjälp av restriktionsenzymer. Dessa enzymer skär DNA på specifika igenkänningsställen och producerar fragment med definierade ändar.
3. Vektorberedning:
* Välj en lämplig vektor: En vektor är en DNA -molekyl som fungerar som en bärare för de genomiska DNA -fragmenten. Vanliga vektorer inkluderar plasmider, bakteriofager och kosmider. Dessa vektorer är konstruerade för att ha specifika funktioner som antibiotikaresistensgener och flera kloningsplatser (MCS) där DNA -fragmenten kan sättas in.
* linearisera vektorn: Vektor -DNA skärs med ett restriktionsenzym som känner igen ett ställe inom MCS, vilket genererar en linjär molekyl med klibbiga ändar.
4. Ligering:
* Kombinera DNA -fragment och vektorer: Det fragmenterade genomiska DNA och lineariserade vektorer blandas tillsammans med DNA -ligas, ett enzym som förenar DNA -fragment genom att bilda fosfodiesterbindningar. Detta skapar rekombinanta DNA -molekyler, där genomiska DNA -fragment sätts in i vektorerna.
5. Transformation:
* introducera rekombinanta molekyler i värdceller: De rekombinanta DNA -molekylerna införs i lämpliga värdceller, ofta bakterier. Dessa celler kan effektivt ta upp främmande DNA -molekyler genom en process som kallas transformation.
* Välj för celler som innehåller rekombinant DNA: Värdcellerna odlas på selektiva media som innehåller antibiotika. Endast celler som bär det rekombinanta DNA med antibiotikaresistensgenen kommer att kunna växa, vilket säkerställer att biblioteket endast innehåller celler som bär de insatta genomiska fragmenten.
6. Biblioteksförstärkning:
* odla de transformerade cellerna: Cellerna som innehåller det rekombinanta DNA odlas och får replikera och producera kolonier. Varje koloni representerar en klon som innehåller ett enda genomiskt DNA -fragment.
* lagra biblioteket: Det genomiska biblioteket kan lagras på olika sätt, inklusive frysta bakteriekulturer eller som en samling plasmid -DNA.
7. Screening och analys:
* Identifiera specifika DNA -fragment: Tekniker som hybridisering och PCR används för att screena biblioteket för specifika gener eller DNA -sekvenser av intresse.
* Analysera DNA -fragmenten: Sekvensering och andra tekniker används för att analysera de klonade DNA -fragmenten, vilket ger värdefull insikt i organismens genom.
Nyckelöverväganden:
* Genomstorlek: Bibliotekets komplexitet beror på att genomens storlek är klonad. Större genom kräver ett större antal kloner.
* vektorkapacitet: Valet av vektor beror på storleken på DNA -fragmenten som ska klonas.
* Host Cell Compatibility: Värdcellen måste kunna ta upp och replikera de rekombinanta DNA -molekylerna effektivt.
* Biblioteksstorlek: Ett komplett genomiskt bibliotek bör innehålla tillräckligt med kloner för att representera hela genomet med stor sannolikhet.
Det genomiska biblioteket fungerar som ett värdefullt verktyg för att studera organisation, struktur och funktion av gener i en organisme. Det är avgörande för olika tillämpningar inom bioteknik, medicin och jordbruk, vilket bidrar till framsteg inom områden som genterapi, diagnostik och förbättring av grödor.
