1. Cellstörning:
* Mekaniska metoder:
* homogenisering: Använd en mixer eller en höghastighetshomogenisator för att fysiskt bryta öppna celler.
* Sonication: Använd ljudvågor för att störa cellmembran.
* fransk press: Tvinga celler genom en liten öppning under högt tryck.
* slipning: Med hjälp av en murbruk och stöt för att fysiskt bryta celler.
* kemiska metoder:
* tvättmedel: Stör cellmembran genom att lösa lipider.
* enzymer: Använd specifika enzymer som lysozym för att försämra cellväggarna.
* osmotisk chock: Ändra lösningens osmotiska tryck för att störa cellmembranen.
2. Differentialcentrifugering:
* Efter cellstörning snurras celllysatet med ökande hastigheter och varaktigheter. Detta separerar komponenter baserat på deras storlek och densitet.
* låghastighetscentrifugering: Pellets större komponenter som kärnor och cellskräp.
* medelhastighetscentrifugering: Pellets mitokondrier och lysosomer.
* Höghastighetscentrifugering: Pelletsmikrosomer och ribosomer.
* Ultracentrifugering: Pellets mindre komponenter som proteiner och nukleinsyror.
3. Densitetsgradientcentrifugering:
* Denna metod förfinar ytterligare separationen som uppnås genom differentiell centrifugering. En lutning av sackaros eller andra ämnen skapas i ett rör, och celllysatet är skiktat på toppen. Under centrifugering rör sig komponenter genom lutningen tills de når en densitet lika med sin egen.
* typer:
* sackarosgradient: Vanligtvis används för att separera organeller.
* cesiumkloridgradient: Utmärkt för isolering av DNA och RNA.
4. Affinitetskromatografi:
* Denna metod utnyttjar den specifika bindningen av en målmolekyl till en immobiliserad ligand på en kolonn.
* ligand: En molekyl som binder specifikt till målmolekylen.
* kolumn: En solid matris med den immobiliserade liganden.
* eluering: Efter bindning elueras målmolekylen från kolonnen med hjälp av en specifik lösning.
5. Elektrofores:
* Används för att separera proteiner baserade på storlek och laddning och nukleinsyror baserade på storlek.
* SDS-PAGE: Separerar proteiner baserat på storlek.
* agarosgelelektrofores: Separerar nukleinsyror baserade på storlek.
6. Immunutfällning:
* Denna metod använder antikroppar för att isolera specifika proteiner.
* antikroppar: Binda till ett specifikt protein av intresse.
* Utfällning: Efter bindning fälls protein-antikroppskomplexet ut ur lösningen.
7. Flödescytometri:
* Denna metod använder lasrar och fluorescerande sonder för att analysera och sortera celler eller cellkomponenter baserat på deras fysiska och biologiska egenskaper.
Exempel:isolerande mitokondrier
* Cellerna störs med hjälp av homogenisering eller en fransk press.
* Celllysatet centrifugeras med medelhastighet till pelletsmitokondrier.
* Pelleten återsuspenderas och renas ytterligare med hjälp av densitetsgradientcentrifugering.
Valet av metod beror på den specifika celltypen, organellen eller molekylen av intresse och den önskade nivån av renhet. Varje teknik har sina styrkor och svagheter, och forskare använder ofta en kombination av metoder för att få önskade resultat.
