Funktionell kloning, även känd som positionell kloning, syftar till att isolera en gen baserad på dess fenotyp och dess kromosomala plats. Här är de viktigaste stegen som är involverade:
1. Identifiera en fenotyp av intresse:
- Börja med en tydlig förståelse av den fenotyp du vill klon. Detta kan vara en sjukdom, en utvecklingsdrag eller någon annan observerbar egenskap.
2. Karta genen till en specifik kromosomal region:
- Länkanalys: Analysera segregeringsmönstren för fenotypen med kända genetiska markörer (som SNP:er eller mikrosatelliter) i en familj eller befolkning. Identifiera markörer som samsegregerar med fenotypen, vilket tyder på att de är nära genen av intresse.
- Föreningsstudier: Korrelerar fenotypen med specifika genetiska varianter (SNP) i en befolkningsbaserad metod. Detta hjälper till att fastställa regioner i genomet associerat med fenotypen.
- kromosomavdelningar/duplikationer: Undersök individer med kromosomala omarrangemang. Om fenotypen påverkas av en borttagning eller duplicering i en specifik region föreslår den att den ansvariga genen ligger inom det området.
3. Begränsa kandidatregionen:
- Fin kartläggning: Använd genetiska markörer med hög täthet och ytterligare familjer/populationer för att förfina platsen för genen inom det tidigare identifierade regionen.
- Fysisk kartläggning: Använd fysiska metoder som kromosompromenader och kromosom som hoppar för att upprätta en fysisk karta över regionen och identifiera överlappande kloner.
- Kandidatgenidentifiering: Identifiera alla gener som finns i det nedtagna området med hjälp av tillgängliga genomiska databaser.
4. Klon och analysera kandidatgener:
- genkloning: Isolat och sekvens -DNA -fragment som innehåller kandidatgenerna med hjälp av tekniker som PCR eller bibliotekscreening.
- Uttrycksanalys: Undersök expressionsmönstret för kandidatgener i vävnader som är relevanta för fenotypen.
- Funktionsstudier: Genomför funktionella analyser (som in vitro eller in vivo -studier) för att bestämma rollen för kandidatgenerna i fenotypen. Detta kan innebära:
- Överuttryck eller knockdown av genen
- Studera effekterna av mutationer i genen
- Undersöker proteininteraktioner mellan genprodukten
5. Validering och bekräftelse:
- Oberoende studier: Replikera resultaten i olika populationer eller experimentella modeller.
- djurmodeller: Skapa djurmodeller med mutationer i den identifierade genen för att bekräfta dess roll i fenotypen.
- terapeutisk potential: Utvärdera genen och dess produkter för potentiella terapeutiska tillämpningar.
Viktig anmärkning:
- Funktionell kloning är ofta en komplex och tidskrävande process.
- Det kräver omfattande genetisk analys, molekylärbiologitekniker och biologisk expertis.
- Framgången för funktionell kloning beror på tillgängligheten av lämpliga genetiska resurser, komplexiteten i fenotypen och den genetiska arkitekturen i egenskaperna.
Alternativ till funktionell kloning:
- nästa generations sekvensering: Möjliggör helgenom- eller exome-sekvensering, vilket underlättar identifiering av gener associerade med specifika fenotyper.
- Genombrett associeringsstudier (GWAS): Ge ett kraftfullt verktyg för att detektera genetiska varianter associerade med komplexa egenskaper, även om de kanske inte direkt identifierar kausala gener.
- omvänd genetik: Börja med en gen och undersöka dess funktion med hjälp av genredigeringsverktyg som CRISPR-CAS9.
Funktionell kloning har spelat en avgörande roll för att förstå den genetiska grunden för olika sjukdomar och egenskaper, vilket bidrar väsentligt till främjandet av medicin och biologi. Men med tillkomsten av ny teknik blir alternativa tillvägagångssätt allt viktigare i genetisk forskning.
