En modifierad typ av Eos-proteinet kan fås att fluorescera när den belyses med blått och rött laserljus. Bakgrund:två proteiner i cytoskelettet i blått och rött. Proteinet som är synligt i rött var märkt med den nya modifierade Eos-typen. (Montage:Mohr MA et al. Angewandte Chemie 2017. Copyright Wiley-VCH. Återges med tillstånd)
Forskare har identifierat mekanismen som gör att fluorescerande proteiner kan byta färg i två faser. De lägger därmed grunden för nya tillämpningar inom mikroskopi och funktionsanalyser inom biologisk forskning.
Det hela började med en observation som ETH-forskare gjorde för ungefär två år sedan med ett speciellt fluorescerande protein isolerat från koraller, Dendra 2, som fluorescerar grönt. Ljus kan användas för att ändra sin molekylära struktur så att det ändrar sin färg till rött. Forskarna upptäckte ett nytt sätt att framkalla denna färgväxling:Först, den exciteras kort med en puls av blått laserljus och belyses sedan omedelbart med nära-infrarött ljus. Tillämpningar för denna tvåfasiga färgbrytare inkluderar fluorescensmikroskopi.
Ett internationellt team av forskare under ledning av Periklis Pantazis, vid Institutionen för biosystemvetenskap och teknik (D-BSSE) vid ETH Zürich i Basel, har nu förklarat denna tvåfasiga färgbrytarmekanism. Forskarna kallar detta "förberedd konvertering". Den nya kunskapen gör att forskarna kan modifiera andra ljuskänsliga proteiner så att de också kan exciteras i två faser.
Forskarna från ETH Zürich, Karlsruhes tekniska högskola, och Janelia Research Campus i Ashburn, Virginia, undersökte noga proteinerna aktiverade med blått ljus och lyckades visa att dessa proteiner går in i ett exciterat tillstånd som varar flera millisekunder. "Det är relativt långt, " förklarar Pantazis. "Andra fluorescensfenomen är mycket kortare."
Forskarna visade också att detta tillstånd är ett fall av ett fenomen känt från kvantkemin - ett "tripletttillstånd". Efter cirka fem millisekunder, det fluorescerande proteinet Dendra 2 återgår till sitt grundtillstånd. Grundad omvandling sker endast om den andra fasen – belysning med nära-infrarött ljus – sker inom tripletttidsfönstret.
Modifierade aminosyrasekvenser
Varaktigheten av tripletttillståndet beror mycket på stabiliteten hos det fluorescerande proteinet. Detta, i tur och ordning, beror på den exakta sekvensen av proteinbyggstenar (aminosyror), vilket är anledningen till att forskarna modifierade Dendra 2-aminosyrasekvensen på flera ställen. Sedan, de gjorde samma sak med ett annat fluorescerande protein, Eos. Tills nu, detta protein kunde inte exciteras i två faser. Det är dokumenterat i den vetenskapliga litteraturen att dessa platser är väsentliga för tripletttillståndet.
När Dendra 2 (till höger med dess fluorescerande kemiska förening) är upplyst med blått laserljus, det fluorescerar grönt. Med violett ljus, den ändrar sin kemiska struktur så att den bara kan fluorescera rött. Denna kemiska strukturförändring inträffar också när den kortvarigt belyses med blått och omedelbart därefter med rött ljus (eller med blått och rött laserljus samtidigt). Kredit:ETH Zürich
Forskarna mätte varaktigheten av tripletttillståndet med alla nya proteiner. Detta tillstånd förlängdes signifikant i flera av de testade proteinerna. Forskarna kunde också modifiera Eos-proteinet så att det också kunde aktiveras i två faser. De lyckades göra detta med ytterligare sex proteiner som aldrig tidigare hade aktiverats i två faser. "De modifierade proteinerna gjordes inte bara omkopplingsbara i två faser för första gången, de är också mer stabila och fluorescerar därför mer intensivt, säger Manuel Mohr, en doktorand i Pantazis grupp och huvudförfattare till studien.
Forskarna gjorde den ursprungliga upptäckten med en laser som inte är konventionellt tillgänglig, som använder ljus i det nära-infraröda området. I dag, dock, forskarna har visat att effekten också kan uppnås med samma konventionella röda lasrar som finns i varje fluorescensmikroskop. Med andra ord, grundad omvandling är möjlig med vilket fluorescensmikroskop som helst.
Grundad konvertering kan användas i mikroskopi för att markera en snävt definierad punkt i ett vävnadsprov. Forskarna gör detta genom att rikta en blå och röd laserstråle in i vävnaden så att strålarna korsar vid en enda punkt. Grundad konvertering sker endast vid denna korsning. "Eftersom varken blått eller rött laserljus har en toxisk effekt, metoden är idealisk för levande organismer, " säger Pantazis. Tillämpningar med andra mikroskopitekniker kan också vara möjliga, inklusive superupplösningsmikroskopi, som har funnits i flera år nu.
Hjärnkartläggning och gensekvensering
"Vi vet nu hur man modifierar fotokonverterbara proteiner för att få dem att byta i två faser, " says Pantazis. The ETH scientists are working together with protein experts to modify other fluorescent proteins used in microscopy in the same way.
The researchers recently modified proteins so that they can be split off from a gene-activating messenger in a way that allows them to be light-activated with two colours. Till exempel, they could illuminate tissue with a blue and red beam intersecting at a single point, making it possible to activate specific genes in a single cell of the tissue. Proteins that detect calcium can be modified in this way, också, and could potentially be used for 3-D brain mapping.
Biologists can ultimately use the new technique for other functional analyses in 3-D. ETH Zurich has already issued several licences for the patent, including to a start-up that plans to develop a DNA sequencing technique using a 3-D matrix.
