En schematisk utveckling av Gamillus. Genet av det fluorescerande proteinet klonades från tentakler av blomsterhattmaneter, och konstruerades för att förbättra den monomera egenskapen och ljusstyrkan. (Blomhattmanet levererades av Kamoizumi i Kamo Aquarium, Yamagata, Japan.) Kredit:Aquarium och Osaka University
Osaka -universitetets forskare utvecklar nytt grönt fluorescerande protein som tål miljö med lågt pH för avbildning av sura organeller
Visualisering av cellulära komponenter och processer på molekylär nivå är viktigt för att förstå grunden för eventuell biologisk aktivitet. Fluorescerande proteiner (FP) är ett av de mest användbara verktygen för att undersöka intracellulär molekylär dynamik.
Dock, FP har användningsbegränsningar för avbildning i miljöer med lågt pH, såsom i sura organeller, inklusive endosomer, lysosomer, och plantera vakuoler. I miljöer med pH mindre än 6, de flesta FP förlorar sin ljusstyrka och stabilitet på grund av deras neutrala pKa. pKa är måttet på syrahållfasthet; ju mindre pKa är, desto surare är ämnet.
"Även om det finns rapporter om flera syra-toleranta gröna FP (GFP), de flesta har allvarliga nackdelar. Vidare, det saknas syra-toleranta GFP:er som är praktiskt tillämpbara för bioavbildning, "säger Hajime Shinoda, huvudförfattare till en Osaka University-studie som syftade till att designa syra-tolerant monomert GFP som praktiskt taget är tillämpligt på levande cellavbildning i sura organeller. "I den aktuella studien, vi utvecklade en syra-tolerant GFP. Vi kallade det Gamillus. "
Figur 2. (vänster) pH-beroende fluorescensegenskap hos Gamillus och EGFP. (Höger) Fluorescensbilder av HeLa -celler som uttrycker Gamillus eller EGFP. Gamillus möjliggör fluorescensobservation av proteinmigration till lysosomer orsakade av makroautofagi. Skala, 10 μm. Upphovsman:Osaka University
Gamillus är en GFP klonad från Olindias formosa (blomsterhattmaneter) och uppvisar överlägsen syra tolerans (pKa =3,4) och nästan dubbelt så mycket ljusstyrka jämfört med de rapporterade GFP:erna. Fluorescensspektrumet är konstant mellan pH 4,5 och 9,0, som faller mellan det intracellulära området i de flesta celltyper. Röntgenkristallografi (en teknik som används för att bestämma atom- och molekylstrukturen hos en kristall, I detta fall, en Gamillus -kristall) och punktmutagenes tyder på att syratoleransen för Gamillus tillskrivs stabilisering av deprotonering i dess kemiska struktur. Resultaten publicerades i Cellkemisk biologi .
"Gamillus tillämplighet som en molekylär tagg visades genom det korrekta lokaliseringsmönstret för Gamillus -fusioner i en mängd olika cellulära strukturer, inklusive sådana som är svåra att rikta in sig på, "säger motsvarande författare Takeharu Nagai." Vi tror att Gamillus kan vara ett kraftfullt molekylärt verktyg för att undersöka okända biologiska fenomen som involverar sura organeller, som autofagi. "
