Proteiner är cellens arbetshästar. Deras aktivitet kontrolleras ofta genom att tillsätta eller ta bort kemikalier som kallas fosfater, som att slå på eller stänga av en elektrisk ström. Mätning av hur många proteiner som är fosforylerade, eller påslagen, har varit en vägspärr för forskning. Eftersom fosforylerade proteiner är svåra att få tag på i stora mängder, de kan vara svåra att analysera, även med hjälp av avancerade instrument som en masspektrometer.

Forskare från Pacific Northwest National Laboratory har utarbetat ett sätt att mäta och särskilja små mängder fosforylerade proteiner, ett tillvägagångssätt som skulle kunna användas i forskning för att hjälpa till att behandla sjukdomar som diabetes och cancer. Studien visas som tidskriftens omslagsartikel den 7 maj Analytisk kemi .

Särskiljande av fosforylerade proteiner

I en masspektrometer, molekyler samlas i en fälla precis framför mätanordningen – som fordon som väntar vid en uppmätt motorvägspåfart, sa medförfattaren Karin D. Rodland, en PNNL-laboratoriestipendiat och biomedicinsk forskare. Fällan släpper när den samlar tillräckligt med molekyler. Detta låter molekylerna röra sig framåt som fordonen när rampljuset blir grönt.

Men när låga nivåer av fosforylerade proteiner finns i ett prov, deras signal är ofta för svag för att en masspektrometer ska kunna upptäcka, så molekylerna fastnar redan innan de mäts.

I den här studien, forskare försökte förstärka signaler för att kringgå barriären och göra även de låga nivåerna av proteiner mätbara. För att kunna göra detta, teamet använde en befintlig teknik som kallas isobarisk märkning, som kemiskt märker prover. Varje tagg är unik och fäster vid och identifierar alla proteiner i ett givet prov. Viktigare, när de individuellt märkta proverna blandas, de blir singel, kemiskt identiskt prov.

"I massspecifikationens ögon, " sa motsvarande författare Tao Liu, en biomedicinsk forskare vid PNNL, "provet visas som en identitet."

Skickligt, forskare taggade och blandade isobariskt ett "boostande" material med studieproverna som var begränsade i kvantitet, vid ett boosting/sampling-förhållande på 30 till 1. Detta boostningsmaterial är biologiskt likt studieproverna så att proteinkatalogerna är likartade och är lättillgängliga i en mycket större mängd. Till exempel, blandade cellinjer kan användas för att efterlikna vävnader.

Kombinationen av förstärkningsmaterialet och studieproverna gjorde den övergripande signalen tillräckligt stor för att detekteras av massspecifikationen. Detta lurade i huvudsak instrumentet - som inte kan göra några mätningar när provet är för litet - att lysa grönt för hela provet för analys.

Tekniken är ungefär som bilar och lastbilar som sorterar sig efter hastighet när de går in på motorvägen, och sedan plocka ut bilarna efter deras färger, sa Rodland. Dessa fordon skulle aldrig ha sorterats om de inte hade fått "gå"-signalen från mätanordningen.

När massspecifikationen bröt isär det isobariskt märkta och blandade provet för analys, förhållandena i vilka taggarna uppträdde gjorde det möjligt för forskarna att bestämma hur mycket av varje peptid som fanns i varje originalprov.

Steg framåt i sjukdomsupptäckt

Genom att använda den isobariska märknings-/förstärkningsstrategin, teamet visade först att tre olika cellinjer av akut myeloid leukemi - en typ av cancer som börjar i benmärgen - effektivt kan särskiljas baserat på deras proteinaktivitetsprofiler, med ett relativt litet antal celler.

Forskare riktade sedan sin uppmärksamhet mot bukspottkörtelöarna, som spelar en central roll vid diabetes. Dessa cellkluster producerar hormoner - insulin och glukagon - som arbetar tillsammans för att förhindra att blodsockernivåerna blir för höga eller för låga. Cellerna är måltavlor hos patienter med typ 1, eller insulinberoende, diabetes. Dock, proteinaktiviteten i mänskliga öar är svår att studera på grund av deras begränsade proteininnehåll. Med den nya tekniken, forskare analyserade förändringar i proteinaktivitet i mänskliga öar som svar på behandling - en länge eftersökt strävan för läkare som övervakar sina patienter.

"Detta kommer att ge oss ny insikt om vad som händer när insulinproducerande celler dör hos patienter med diabetes, sa Wei-Jun Qian, den andra motsvarande författaren till artikeln och en biomedicinsk forskare vid PNNL. "Förmågan att spåra proteinaktivitet mer rigoröst kommer att hjälpa oss att förstå vilka signalvägar som är involverade i celldöd."

Vid horisonten

Det nya tillvägagångssättet lovar olika typer av biologisk och biomedicinsk forskning när provmaterial är ont om. Användningsområden kan innefatta att jämföra celler före och efter läkemedelsbehandling, testa olika doser, eller studera tidpunkten för proteinaktivering eller deaktivering.

"Möjligheterna är oändliga, " sa Liu. "Du kan göra mycket storskalig kvantifiering, och du kan även blanda många olika förhållanden du vill studera i ett experiment."