Platsstyrd spinnmärkning (SDSL) som används i kombination med elektronparamagnetisk resonans (EPR) spektroskopi har varit en beprövad och pålitlig teknik för att klargöra strukturen, funktion och dynamik hos proteiner och proteinkomplex. Nitroxidbaserade spinnetiketter är bland de mest populära och bäst etablerade eftersom de är små, icke-störande och uppvisar utmärkta spektroskopiska egenskaper. "Ideala spinnmärkningsprocedurer uppvisar höga reaktionshastigheter och selektivitet, " förklarar professor Malte Drescher, Professor för spektroskopi av komplexa system vid universitetet i Konstanz avdelning för kemi och huvudförfattare till studien tillsammans med professor Valentin Wittmann, som är specialiserad på organisk syntes.

"Att uppnå hög reaktivitet och hög selektivitet på samma gång kan vara ett problem, " fortsätter Drescher. "Baserade på konventionella spinnetiketter, till exempel, på Gadolinium(III) eller trityl, visa antingen mycket breda spektra och låga moduleringsdjup eller mycket smala spektra som är olämpliga för den typ av experiment som vi vill genomföra." En ny studie publicerad av Drescher, Wittmann och deras team av University of Konstanz kemister, som publicerades online i tidskriften ChemBioChem Communications den 14 augusti 2019, introducerar ett nytt tillvägagångssätt för märkning av proteiner som innehåller nitroxidbaserade spin-etiketter och genetiskt kodade icke-kanoniska aminosyror (ncAA) som mål för SDSL.

"Nitroxider ger idealisk spektral bredd och tillgång till dynamisk information, " säger Anandi Kugele, en doktorandforskare vid Konstanz Research School of Chemical Biology (KoRS-CB) och första författare till studien, som fick ett prestigefyllt resestipendium från National High Magnetic Field Laboratory för att presentera resultaten vid 2019 Rocky Mountain Conference on Magnetic Resonance i Denver, Colorado (USA). "Traditionella nitroxidbaserade etiketter har begränsad redoxstabilitet, vilket är en nackdel för applikationer i cellen. Utmaningen för oss var att öka nitroxidstabiliteten och därmed anpassa nitroxidbaserade spinnetiketter för framtida rutinin vivo-användning." forskarna utvecklade en ny spin-etikett som kan fästas på proteiner med hjälp av Diels-Alder (DAinv) cykloaddition med omvänd elektronbegäran till genetiskt kodade ncAA, en metod som har visat sig vara lämplig för ett brett spektrum av in vitro och in vivo applikationer. För att uppnå nitroxidstabilitet, forskarna använde vidare en skyddsstrategi baserad på fotoborttagbara skyddsgrupper, som är kända för att skydda nitroxider och släppa ut dem vid behov.

Den nya spinnetiketten – kallad fotoaktiverbar nitroxid för DAinv-reaktion, eller PaNDA för kort—är vattenlöslig, EPR-aktiv och avskyddningseffektiv som både in vitro och i lysattest med de två modellproteinerna grönt fluorescerande protein (GFP) och Escherichia coli oxidoreduktas tioredoxin (TRX), som finns i praktiskt taget alla kända organismer, föreslå. "Vi behöver förbättra metoden som används för att leverera PaNDA-spinetiketten till celler och för att testa märknings- och avskyddningseffektiviteten inuti cellen, bland annat, " avslutar Malte Drescher:"Men vår forskning visar tydligt att, i princip, PaNDA-märkningen kan användas för EPR-mätningar i utmanande biologiska miljöer, inklusive insidan av celler. Våra tester med E. coli-lysat är mycket lovande i detta avseende. Detta kommer att öppna upp ett helt nytt utbud av möjligheter för studier av proteiner med hjälp av EPR-spektroskopi."