En forskargrupp ledd av Kobe University har belyst mekanismen genom vilken cyanobakterier (Synechocystis sp. PCC 6803) producerar D-laktat, visar att äppelsyraenzymet underlättar denna produktion. Senare, de lyckades producera världens högsta andel (26,6 g/L) av D-laktat direkt från CO ₂ och ljus genom att modifiera D-laktatsyntesvägen med hjälp av genteknik.

Det förväntas att denna framgång kommer att bidra till utvecklingen av viktiga processteknologier för framställning av polymjölksyra, som används för att tillverka biologiskt nedbrytbar plast. Detta kan bidra till att göra konceptet med en hållbar, ett koldioxidsnålt samhälle en realitet.

Forskargruppen bestod av professor HASUNUMA Tomohisa (från Kobe Universitys Engineering Biology Research Center), Projektdocent HIDESE Ryota (vid Kobe Universitys Graduate School of Science, Technology and Innovation) och docent OSANAI Takashi (vid Meiji University's School of Agriculture).

Resultaten av denna forskning publicerades online i den internationella vetenskapliga tidskriften ACS syntetisk biologi den 31 januari, 2020.

Användningen av bioproduktion för att syntetisera mångsidiga kemiska föreningar och funktionella råvaror som vanligtvis härrör från olja är avgörande för både miljön och resurshållbarheten. På senare år har bioproduktionsmetoder som använder mikrober har fått uppmärksamhet. Bland dessa mikrober finns mikroalger. Det är möjligt att framställa olika användbara ämnen som oljor och pigment från mikroalger med hjälp av solljus och CO ₂ .

Cyanobakterier är en typ av snabbväxande mikroalger som är lätta att genetiskt modifiera. Cyanobakterier har använts för att producera D-laktat tidigare, dock har det låga utbytet varit ett hinder som hindrar den praktiska tillämpningen av dessa metoder.

Cyanobakterier blir CO ₂ till sockret glykogen via fotosyntes. Om cyanobakterier som har ackumulerat glykogen i sina celler sedan placeras i en mörk miljö utan syre, glykogenet metaboliseras av cyanobakterierna och det utsöndrar organiska syror (som bärnstenssyra och mjölksyra) i odlingsmediet.

För att syntetisera D-laktat från cyanobakterier, det måste ske en ökning av pyruvatproduktionen. Den här forskargruppen upptäckte att äppelsyraenzymet, som omvandlar äppelsyra till pyruvat, är avgörande för produktionen av D-laktat. De använde dynamisk metabolomik för att belysa mekanismen bakom produktionen av D-laktat. Genom denna analys, de upptäckte att när överdrivet äppelenzym produceras inuti cellerna, inte bara omvandlas äppelsyra till pyruvat, men också vägen för att producera pyruvat från glykogen är aktiverad (Figur 1). D-laktat biosyntetiseras från pyruvat av D-laktatdehydrogenas. Forskargruppen lyckades producera 26,6 g/L D-laktat med en omvandlingsgrad på 94,3 % från det ackumulerade glykogenet genom att genmanipulera D-laktatdehydrogenaset för att optimera dess funktion (Figur 2).

Denna forskning representerar ett viktigt framsteg mot utvecklingen av en industriell process för att producera D-laktat från CO ₂ . Gruppen har som mål att fortsätta att öka produktionen av D-laktat genom optimering av metabola vägar och analys av odlingsförhållanden.

Det finns en stor marknad för D-laktat, som kan användas som råvara i produktionen stereokomplex PLA som är en biologiskt nedbrytbar plast. Å andra sidan, hög renhet och produktivitet krävs för att göra biologiskt syntetiserad D-laktat med hjälp av mikrober livsdugligt. Det finns bioproduktionsmetoder som använder heterotrofa mikrober som E. coli, dessa använder dock socker (glukos) från majs eller sockerrör som en energikälla för produktion. Detta innebär att odling av dessa växter för bioproduktion orsakar en mängd problem, såsom konkurrens med matkällor, användning av åkermark och sötvattenresurser, och bidrag till miljöförstöring (till exempel, avskogning).

Cyanobakterier, å andra sidan, är en idealisk mikrob för att producera användbara ämnen, eftersom det kan omvandla CO ₂ fixeras via fotosyntes till olika målföreningar. Dessutom, cyanobakterier har en mycket högre fotosyntesförmåga än växter, vilket innebär att den till och med kan odlas under starkt ljus. Den kräver ingen jord och många sorter kan odlas i havsvatten. Därför hoppas man att cyanobakterier kan ge den ultimata basen för bioproduktion eftersom den bara kräver solljus, CO ₂ och havsvatten.

Det är allmänt känt att cyanobakterier kan ge ett sätt att syntetisera D-laktat, och försök har gjorts för att öka D-laktatproduktionen med hjälp av genetisk modifiering. Dock, nästan alla system som producerar D-laktat är kopplade till förökning via fotosyntes så låga mängder av detta målämne syntetiseras. Anledningen till detta är att mekanismen för D-laktatproduktion i cyanobakterier inte har förståtts väl.

Metabolomanalystekniker tillåter forskare att både identifiera och beräkna mängden föreningar som finns inuti celler. Denna forskargrupp utvecklade "Dynamic Metabolomics" som gjorde det möjligt för dem att observera mängden ämnen som metaboliseras över tiden.

Synechocystis sp. PCC 6803 cyanobakterier som används i denna studie är en av de vanligaste cyanobakterierna i världen. Det är en modellorganism för fotosyntatproduktion eftersom den är lätt att genetiskt modifiera och växer snabbt. Tidigare forskning utförd av denna grupp med hjälp av dynamisk metabolomik visade att bärnstenssyra huvudsakligen produceras via äppelsyra i Synechocystis sp. PCC 6803. Den aktuella studien fokuserade på äppelsyraenzym, som omvandlar äppelsyra till pyruvat. Först, de syftade till att belysa effekterna av äppelsyraenzym på metabolismen av Synechocystis sp. PCC 6803 genom dynamisk metabolomik. Deras efterföljande mål var att öka D-laktatproduktionen med hjälp av metabolisk ingenjörskonst.

Forskningsmetodik

Två typer av celler skapades för att heltäckande undersöka mekanismen bakom produktionen av D-laktat:1. Celler som inte hade någon äppelenzymfunktion och 2. Celler där denna funktion var optimerad, leder till ett överuttryck av äppelsyraenzym.

Dynamisk metabolomik användes för att analysera skillnaden i metabolismen mellan dessa två celler. Man fann att mer pyruvat producerades från glykogen när nivån av äppelsyra i cellerna var låg (Figur 1).

Forskargruppen har ytterligare genetiskt modifierade äppelenzymoptimerade celler för att överuttrycka D-laktatdehydrogenas, och förbättrade D-laktatdehydrogenasets funktion att producera D-laktat från pyruvat. Dessutom, gruppen genetiskt modifierade cellerna för att ta bort enzymet acetatkinas för att undertrycka produktionen av biproduktsyror.

Den modifierade Synechocystis sp. PCC 6803 odlades sedan i en mörk anoxisk miljö (fermenteringsförhållanden). Under dessa omständigheter, cellerna nådde den optimala tätheten. Denna forskargrupp överskred vida världens tidigare högsta avkastning av D-laktat (10,7 g/L), genom att producera 26,6 g/L med en hastighet av 0,185 g/L/h (Figur 2). Man tror att detta fynd kan bidra till en låg kostnadsprocess för att producera höga nivåer av D-laktat.

Vidare forskning

Cyanobakterier kan användas för att producera många mångsidiga kemiska föreningar och funktionella råmaterial, denna teknik är dock inte tillräckligt väl utvecklad för att kunna implementeras i industriell skala. Det stora problemet är att lägre nivåer av målföreningen produceras med hjälp av cyanobakterier, jämfört med de mängder som produceras vid användning av heterotrofa mikroorganismer. Den aktuella forskningen har visat att den dynamiska metabolomiska analysen är mycket effektiv för att utvärdera funktionen av Synechocystis. Baserat på resultatet av den dynamiska metabolomiken, denna grupp gjorde det möjligt för Synechocystis att prestera på sin fulla potential genom att genetiskt modifiera sin metabolism.

Förhoppningen är att öka den fotosyntetiska produktiviteten hos cyanobakterier genom dynamisk metabolomik och metabolisk ingenjörskonst skulle kunna bidra till förverkligandet av en hållbar, samhälle med låga koldioxidutsläpp.