Optiska undersökningar och manipulationer utgör ofta kärnan i biologiska experiment. I en ny rapport som nu publicerats i Vetenskapliga framsteg , Kazuki Okamato och ett team av forskare inom farmaceutiska vetenskaper, neurovetenskap, medicin, fysik och artificiell intelligens vid University of Tokyo, Japan, introducerade ett nytt borsilikatglasmaterial som innehåller ett sällsynt jordartsterbium (III) (Tb ³⁺ ). Materialet avger grön fluorescens vid blåsexcitation, ungefär som grönt fluorescerande protein (GFP) med bred kompatibilitet i biologiska forskningsmiljöer. Med hjälp av mikropipetter av terbiumdopat glas, Okamato et al. riktade GFP-märkta celler för encells elektroporering, encells transkriptomanalys och patch-clamp inspelnings experiment under realtid fluorescens mikroskopisk kontroll. Glaset visade också potentiell tredje harmonisk generation vid infraröd laser excitation, användbar för online optisk inriktning av fluorescensmärkta neuroner i neocortex in vivo. På det här sättet, det terbiumdopade glaset förenklade flera procedurer i biologiska experiment med bredare tillämpningar inom biomedicinsk forskning.

Genomföra optiska undersökningar in vivo

Optiska undersökningar och cellmanipulationer i levande vävnader är utbredda inom biologisk forskning med kapacitet att avslöja olika egenskaper i celler och under intracellulär kommunikation. Medan genetisk märkning har möjliggjort identifiering av celler som uttrycker fluorescerande proteiner är det fortfarande svårt att komma åt fluorescensmärkta celler med hjälp av glaspipetter eftersom glas inte är fluorescerande i det synliga området. För att lösa dessa tekniska problem, Okamato et al. introducerade en ny sammansättning av borsilikatglas. De sällsynta jordens joner visade unikt fluorescensemission med skarpa toppar i det synliga ljusspektrumet. Teamet fokuserade på terbium (III) (Tb ³⁺ ), som har komplexa energinivåstrukturer och som teoretiskt förväntas avge grön fluorescens. Excitationsvåglängden var nära den högsta synligheten för mänskliga ögon och nära den för grönt fluorescerande protein. Som ett resultat, pipetter av terbiumdopade glasögon var användbara för fluorescensinriktade, encelliga manipulationer inom biovetenskap.

Teamet utvecklade borsilikatglaset med 3,1 molprocent (mol %) terbiumoxid (Tb ₂ O ₃ ). Terbium (Tb ³⁺ ) -dopedglas som avger grön fluorescens som är synlig för blotta ögat, även under rumsljus. Tb ³⁺ -dopat glas hade en absorptionstopp vid en våglängd på 484 nm, som inte observerades i normalt borsilikatglas utan terbium. Forskarna producerade glaskapillärer och pipetter där det gjutna glaset fortsatte att avge grön fluorescens. Med hjälp av svepelektronmikroskopi, laget kontrollerade pipettspetsarna för eventuella avvikelser som kan påverka kvaliteten på elektrofysiologiska inspelningar. Okamato et al. använde sedan de nya mikropipetterna för att genomföra encells elektroporering av ett rött fluorescerande protein (tdTomato) till neuroner i råttorotypiska hippocampusskivstrukturer. De tittade på pipetterna som innehöll den röda färgämnesvektorn och pyramidala celler som var minimalt märkta med förbättrad GFP, med samma optiska apparat. Forskarna fäst pipettspetsarna på cellerna och applicerade elektriska pulser för elektroporering för att underlätta uttrycket av det röda färgämnet efter 48 timmar. Därefter, laget utförde encellad RNA-sekvensering med pipetterna i akuta skivor av musens primära motoriska cortex av transgena möss.

Användning av de nya mikropipetterna för in vitro -klämmainspelningar

Forskarna genomförde sedan patch-clamp inspelningar från primära kulturer av hippocampusneuroner som var glesmärkta med GFP med hjälp av en terbiumdopad pipett laddad med ett rött fluorescerande färgämne (Alexa Fluor 594). Pipetterna fyllde framgångsrikt målcellerna med färgämnet och höll dem i helcellskonfigurationen. Teamet tillämpade samma metod för akuta hjärnskivspreparat där neuroner befann sig djupare i mindre transparenta vävnader än odlade neuroner. När Okamato et al. lappade pyramidceller i de akuta hippocampusskivorna med hjälp av terbiumdopade pipetter, neuronerna visade normala åtgärdspotentialer som svar på korta ströminjektioner. Cellerna uppvisade normala spontana excitatoriska och hämmande postsynaptiska strömmar under spänningsklemkonfigurationen. Mikropipetterna kunde användas för långsiktiga stabila inspelningar och var också användbara för inspelningar från neuriter. Teamet registrerade bakpropagerande åtgärdspotentialer med hjälp av installationen från riktade dendriter.

In vivo patch-clamp inspelningar med terbiumdopade pipetter

Okamato et al. next characterized the nonlinear multiphoton excitation of terbium-doped glass using infrared light at wavelengths that were approximately double the single-photon excitation peak (484 nm) of terbium. Using a photomultiplier tube through a 495-to-540 nm band-pass filter, the team captured the green fluorescence emitted by terbium-doped pipettes. The emissions peaked at an excitation wavelength of 975 nm, suggesting that a laser wavelength corresponding to the value excited the glass through a two-photon absorption process. The scientists also noted another bright signal at 1300 nm excitation through a 410-to-450 band pass filter and suggested the signal to have likely arisen from third harmonic generation (THG). Based on the strong THG signal of the micropipettes, Okamato et al. conducted in vivo whole cell patch-clamp recordings with a multiphoton laser microscope. They simultaneously used the cells and terbium-doped pipette using dual-laser irradiation at 1, 040 nm and 1, 300 nm, respektive, and recorded the injection-induced action potentials and spontaneous membrane fluctuations under the current-clamp configuration.

På det här sättet, Kazuki Okamato and colleagues invented a terbium-doped glass emitting green fluorescence signal strong enough to be visible to the naked eye. The material had similar characteristics to conventional borosilicate glass and did not display photobleaching or cytotoxicity. The new micropipettes allowed fluorescence manipulations such as optical targeting of single-cell electroporation, single-cell RNA sequencing and electrophysiological recordings. The glass also emitted third harmonic generation upon three-photon excitation, applicable for in vivo manipulation. The terbium-doped glass therefore provided a platform for multiple purposes in biomedical research including hitherto conventional patch-clamp recordings to open new frontiers in life sciences.

© 2021 Science X Network