1. Lysbuffert:
* Funktion: Bryter öppna celler och frigör DNA.
* komponenter:
* tvättmedel: Stör cellmembran (t.ex. SDS, Triton X-100).
* Salt: Hjälper till att neutralisera laddade molekyler och stabilisera DNA (t.ex. NaCl).
* tris buffert: Upprätthåller pH för optimal enzymaktivitet.
* edta: Kelatingmedel som binder till divalent katjoner som magnesium och förhindrar DNA -nedbrytning med DNaser.
2. Proteinas K:
* Funktion: Digests proteiner, inklusive histoner som binder till DNA.
* Mekanism: Ett serinproteas som klyver peptidbindningar inom proteiner.
* Syfte: Tar bort proteiner som kan störa DNA -isolering och rening.
3. Fenol/kloroform:
* Funktion: Separerar DNA från proteiner och annat cellulärt skräp.
* Mekanism: Fenol förnekar proteiner och gör dem olösliga, medan kloroform fungerar som en denaturant och hjälper till att separera de vattenhaltiga och organiska faserna.
* Förfarande: Efter kraftig skakning separeras blandningen i tre lager:
* Toppskiktet:Vattenfas som innehåller DNA.
* Mittlager:Interfas som innehåller denaturerade proteiner.
* Bottenlager:Organisk fas innehållande fenol/kloroform.
* DNA återvinns från det vattenhaltiga skiktet.
4. Etanol/isopropanol:
* Funktion: Utfäller DNA från lösningen.
* Mekanism: DNA är lösligt i vatten men olösligt i etanol eller isopropanol. När de tillsätts minskar dessa alkoholer lösligheten för DNA, vilket får det att fälla ut ur lösningen.
* Förfarande: Efter tillsats av etanol eller isopropanol centrifugeras blandningen för att samla DNA -pelleten.
5. TE -buffert:
* Funktion: Återuppstår och lagrar DNA efter extraktion.
* komponenter:
* tris buffert: Upprätthåller pH för optimal DNA -stabilitet.
* edta: Kelateringsmedel som hämmar dNaser.
* Syfte: Säkerställer att DNA förblir intakt och skyddat från nedbrytning under lagring.
6. RNase A:
* Funktion: Tar bort RNA -förorening.
* Mekanism: Ett enzym som specifikt försämrar RNA.
* Syfte: Säkerställer ett rent DNA -prov för nedströmsapplikationer som PCR eller sekvensering.
Obs: Vissa protokoll kan använda andra kemikalier som guanidinhydroklorid eller guanidintiocyanat för lysering, eller kiseldioxidkolonner för DNA -bindning och rening istället för fenol/kloroform.
