Förmågan att omvandla solljus till energi är en av naturens mer anmärkningsvärda bedrifter. Forskare förstår den grundläggande processen för fotosyntes, men många avgörande detaljer förblir svårfångade, inträffar vid dimensioner och flyktiga tidsskalor som länge ansetts för små för att undersöka.

Nu, det håller på att förändras.

I en ny studie, ledd av Petra Fromme och Nadia Zatsepin vid Biodesign Center for Applied Structural Discovery, skolan för molekylära vetenskaper och institutionen för fysik vid ASU, forskare undersökte strukturen av Photosystem I (PSI) med ultrakorta röntgenpulser vid European X-ray Free Electron Laser (EuXFEL), ligger i Hamburg, Tyskland.

PSI är ett stort biomolekylärt system som fungerar som en solenergiomvandlare som omvandlar solenergi till kemisk energi. Fotosyntesen ger energi till allt komplext liv på jorden och tillför det syre vi andas. Framsteg när det gäller att reda ut fotosyntesens hemligheter lovar att förbättra jordbruket och hjälpa till med utvecklingen av nästa generations solenergilagringssystem som kombinerar naturens effektivitet med stabiliteten hos mänskliga konstruerade system.

"Detta arbete är så viktigt, eftersom det visar det första beviset på konceptet för megahertz seriell kristallografi med ett av de största och mest komplexa membranproteinerna i fotosyntesen:Photosystem I", säger Fromme. "Arbetet banar väg mot tidsupplösta studier vid EuXFEL för att fastställa molekylära filmer av den ljusdrivna vägen för elektronerna i fotosyntesen eller visualisera hur cancerläkemedel attackerar felaktiga proteiner."

EuXFEL, som nyligen startade sin verksamhet, är den första att använda en supraledande linjäraccelerator som ger spännande nya funktioner inklusive mycket snabba megahertz-repetitionshastigheter av dess röntgenpulser – över 9 000 gånger snabbare än någon annan XFEL – med pulser separerade med mindre än 1 miljondels sekund. Med dessa otroligt korta utbrott av röntgenljus, forskare kommer att mycket snabbare kunna spela in molekylära filmer av grundläggande biologiska processer och kommer sannolikt att påverka olika områden inklusive medicin och farmakologi, kemi, fysik, materialvetenskap, energiforskning, miljöstudier, elektronik, nanoteknik, och fotonik. Petra Fromme och Nadia Zatsepin är medförfattare till tidningen, publiceras i det aktuella numret av tidskriften Naturkommunikation .

Styrka i siffror

Fromme är chef för Biodesign Center for Applied Structural Discovery (CASD) och leder de experimentella teaminsatserna för projektet, medan Zatsepin ledde XFELs dataanalysteam.

"Detta är en viktig milstolpe i utvecklingen av seriell femtosekundkristallografi, bygger på den välkoordinerade insatsen från en stor, tvärvetenskapligt, internationellt team och år av utveckling inom olika områden", betonar Zatsepin, tidigare forskarassistent vid ASU Institutionen för fysik och biodesign CASD, och nu seniorforskare vid La Trobe University i Australien.

Christopher Gisriel, tidningens första författare, arbetade med projektet medan han var postdoktor i Fromme-laboratoriet och är exalterad över projektet. "Snabb datainsamling i seriella femtosekundskristallografiexperiment gör denna revolutionerande teknik mer tillgänglig för dem som är intresserade av struktur-funktionsförhållandet för enzymer. Detta exemplifieras av vår nya publikation i Naturkommunikation visar att även de svåraste och mest komplexa proteinstrukturerna kan lösas genom seriell femtosekundkristallografi samtidigt som data samlas in med megahertz-repetitionshastighet."

"Det är väldigt spännande att se det hårda arbetet från de många människor som drev det här projektet att förverkligas, " säger Jesse Coe, co-förste författare som tog examen förra året med en Ph.D. i biokemi från ASU. "Detta är ett stort steg i rätt riktning mot att bättre förstå naturens process för elektronöverföring som har förfinats under miljarder år."

Extrem vetenskap

En XFEL (för röntgenfri elektronlaser) levererar röntgenljus som är en miljard gånger ljusare än konventionella röntgenkällor. Den lysande, laserliknande röntgenpulser produceras av elektroner som accelereras till nära ljusets hastighet och matas genom gapet mellan serier av alternerande magneter, en anordning som kallas en undulator. Undulatorn tvingar elektronerna att vicka och samlas i diskreta paket. Var och en av de perfekt synkroniserade vicklande elektronknippen avger en kraftfull, kort röntgenpuls längs elektronflygbanan.

I seriell femtosekundkristallografi, en stråle av proteinkristaller injiceras i banan för den pulserade XFEL-strålen vid rumstemperatur, ger strukturell information i form av diffraktionsmönster. Från dessa mönster, forskare kan bestämma bilder i atomskala av proteiner i nära inhemska förhållanden, banar väg för exakta molekylära filmer av molekyler i arbete.

Röntgenstrålar skadar biomolekyler, ett problem som har plågat strukturbestämmande ansträngningar i decennier, kräver att biomolekylerna fryses för att begränsa skadan. Men röntgenskurarna som produceras av en XFEL är så korta – varar bara femtosekunder – att röntgenstrålning från en molekyl kan registreras innan förstörelse äger rum, liknande att använda en snabb kameraslutare. Som referenspunkt är en femtosekund en miljondels miljarddels sekund, samma förhållande som en sekund är 32 miljoner år.

På grund av sofistikeringen, storlek och kostnad för XFEL-anläggningar, endast fem är för närvarande tillgängliga för sådana experiment över hela världen – en allvarlig flaskhals för forskare eftersom varje XFEL vanligtvis bara kan vara värd för ett experiment åt gången. De flesta XFEL genererar röntgenpulser mellan 30 och 120 gånger per sekund och det kan ta flera timmar till dagar att samla in de data som krävs för att bestämma en enda struktur, än mindre en serie ramar i en molekylär film. EuXFEL är den första som använder en supraledande linjäraccelerator i sin design, möjliggör den snabbaste följden av röntgenpulser av alla XFEL, vilket avsevärt kan minska tiden det tar att fastställa varje struktur eller bildruta i filmen.

Hög risk, hög belöning

Eftersom provet utplånas av de intensiva röntgenpulserna, den måste fyllas på i tid för nästa röntgenpuls, vilket krävde att PSI-kristaller skulle levereras 9 000 gånger snabbare vid EuXFEL än vid tidigare XFEL - med en jethastighet på cirka 50 meter per sekund (160 fot per sekund), som en mikrofluidisk brandslang. Detta var utmanande eftersom det kräver stora mängder av det dyrbara proteinet som finns i enhetliga kristaller för att nå dessa höga jethastigheter och undvika att blockera provleveranssystemet. Stora membranproteiner är så svåra att isolera, kristallisera och leverera till strålen, att det inte var känt om denna viktiga klass av proteiner kunde studeras vid EuXFEL.

Teamet utvecklade nya metoder som gjorde det möjligt för PSI, som är ett stort komplex bestående av 36 proteiner och 381 kofaktorer, som inkluderar de 288 klorofyllerna (de gröna pigmenten som absorberar ljuset) och har över 150, 000 atomer och är över 20 gånger större än tidigare proteiner som studerats vid EuXFEL, att få sin struktur bestämd vid rumstemperatur till en anmärkningsvärd upplösning på 2,9 Ångström – en betydande milstolpe.

Miljarder mikrokristaller av PSI-membranproteinet, härrör från cyanobakterier, måste odlas för den nya studien. Snabb kristalltillväxt från nanokristallfrön krävdes för att garantera den väsentliga enhetligheten av kristallstorlek och form. PSI är ett membranprotein, vilket är en klass av proteiner av hög betydelse som har varit notoriskt svåra att karakterisera. Deras utarbetade strukturer är inbäddade i cellmembranets lipiddubbelskikt. Vanligtvis, de måste noggrant isoleras i fullt aktiv form från sin ursprungliga miljö och omvandlas till ett kristallint tillstånd, där molekylerna packas till kristaller men bibehåller all sin naturliga funktion.

När det gäller PSI, detta uppnås genom att extrahera det med mycket milda rengöringsmedel som ersätter membranet och omger proteinet som ett innerslang i poolen, som efterliknar den naturliga membranmiljön och håller PSI fullt funktionell när den väl packats i kristallerna. Så när forskare lyser på de gröna pigmenten (klorofyllerna) som fångar ljuset av PSI:s antennsystem, energin används för att skjuta en elektron över membranet.

För att hålla PSI fullt fungerande, kristallerna är endast svagt packade och innehåller 78 % vatten, vilket gör dem mjuka som en smörbit i solen och gör det svårt att hantera dessa ömtåliga kristaller. "Att isolera, karakterisera och kristallisera ett gram PSI, eller en miljard miljarder PSI-molekyler, för experimenten i sin fullt aktiva form var en enorm ansträngning av studenterna och forskarna i mitt team", säger Fromme." I framtiden, med ännu högre upprepningsfrekvenser och nya provleveranssystem kommer provförbrukningen att minska dramatiskt."

Registreringen och analysen av diffraktionsdata var en annan utmaning. En unik röntgendetektor utvecklades av EuXFEL och DESY för att hantera kraven från strukturbiologiska studier vid EuXFEL:den adaptiva förstärkningsintegrerande pixeldetektorn, eller AGIPD. Var och en av AGIPDs 1 miljon pixlar är mindre än en hundradels tum i diameter och innehåller 352 analoga minnesceller, som gör det möjligt för AGIPD att samla in data med megahertzhastigheter över ett stort dynamiskt område. Dock, För att samla in exakta kristallografiska data från mikrokristaller av stora membranproteiner krävdes en kompromiss mellan rumslig upplösning och provtagning av data.

"Att driva på datainsamling med högre upplösning med den aktuella detektorstorleken kan förhindra användbar bearbetning av kristallografiska data eftersom diffraktionsfläckarna inte löses tillräckligt av röntgendetektorpixlarna" varnar Zatsepin, "Ändå när det gäller datahastigheter och dynamiskt omfång, vad AGIPD kan är otroligt."

Den nya programvaran för datareduktion och kristallografisk analys som är utformad specifikt för att hantera utmaningarna som är unika för de enorma datamängderna inom XFEL-kristallografi, vars utveckling leddes av medarbetare på CFEL, DESY, och ASU, har kommit långt sedan det första högupplösta XFEL-experimentet 2011.

"Vår mjukvara och DESYs högpresterande beräkningsmöjligheter sätts verkligen på prov med de oöverträffade datavolymerna som genereras vid EuXFEL. Det är alltid spännande att tänja på gränserna för den senaste tekniken, ", tillägger Zatsepin.

Membranproteiner:floppy, ändå formidabel

Membranproteiner som PSI – namngivna för att de är inbäddade i cellmembranen – är avgörande för alla livsprocesser inklusive andning, nervfunktion, näringsupptag, och cell-cell-signalering. Eftersom de är på ytan av varje cell är de också de viktigaste läkemedelsmålen. Mer än 60 % av alla nuvarande läkemedel är inriktade på membranproteiner. Utformningen av effektivare läkemedel med färre biverkningar är därför beroende av att förstå hur särskilda läkemedel binder till sina målproteiner och deras mycket detaljerade strukturella konformationer och dynamiska aktiviteter.

Trots deras enorma betydelse inom biologi, membranproteinstrukturer utgör mindre än 1% av alla proteinstrukturer som har lösts hittills eftersom de är notoriskt svåra att isolera, karaktärisera och kristallisera. Det är därför stora framsteg inom kristallografiska metoder, såsom tillkomsten av membranprotein megahertz seriell femtosekundkristallografi, kommer utan tvekan att ha en betydande inverkan på det vetenskapliga samfundet.

Det krävs en by

Dessa senaste prestationer skulle inte vara möjliga utan den outtröttliga ansträngningen från ett dedikerat team på nästan 80 forskare från 15 institutioner, inklusive ASU, den europeiska XFEL, DESY, Center for Ultrafast X-ray Science, Hauptman-Woodward Institute, SUNY Buffalo, SLAC, Universitetet i Hamburg, Högskolan i Göttingen, Ungerska vetenskapsakademin, University of Tennessee, Lawrence Livermore National Laboratory, University of Southampton, Hamburgs tekniska universitet, University of Wisconsin. Forskargruppen inkluderade amerikanska medarbetare i NSF BioXFEL Science and Technology Center och en grupp internationella medarbetare, inklusive Adrian P. Mancuso och Romain Letrun, ledande forskare vid EuXFEL-strållinjen och Oleksandr Yefanov och Anton Barty från CFEL/DESY som arbetade nära ASU-teamet med komplex dataanalys.