Med en avancerad röntgenkombinationsteknik, forskare har spårat nanobärare för tuberkulosläkemedel i celler med mycket hög precision. Metoden kombinerar två sofistikerade skanningsröntgenmätningar och kan lokalisera små mängder av olika metaller i biologiska prover med mycket hög upplösning, som ett team kring DESY-forskaren Karolina Stachnik rapporterar i tidskriften Vetenskapliga rapporter . För att illustrera dess mångsidighet, forskarna har också använt kombinationsmetoden för att kartlägga kalciumhalten i mänskligt ben, en analys som kan gynna osteoporosforskningen.

"Metaller spelar nyckelroller i många biologiska processer, från syretransporten i våra röda blodkroppar och mineraliseringen av ben till den skadliga ackumuleringen av metaller i nervceller som ses vid sjukdomar som Alzheimers, " förklarar Stachnik som arbetar i Center for Free-Electron Laser Science (CFEL) vid DESY. Högenergiröntgen får metaller att lysa upp i fluorescens, en metod som är mycket känslig även för små mängder. "Dock, röntgenfluorescensmätningarna visar vanligtvis inte ultrastrukturen hos en cell, till exempel, " säger DESY-forskaren Alke Meents som ledde forskningen. "Om du vill hitta metallerna i ditt prov exakt, du måste kombinera mätningarna med en avbildningsteknik." Ultrastrukturen omfattar detaljerna i cellmorfologin som inte är synliga under ett optiskt mikroskop.

Som biologiska prover, såsom celler, är mycket känsliga för röntgenstrålning, det är mycket fördelaktigt att avbilda deras struktur samtidigt med fluorescensanalysen. Av denna anledning, teamet kombinerade fluorescensmätningarna med en avbildningsmetod som kallas ptykografi. "Ett ptykografiskt mikroskop är ganska likt att ta en panoramabild, " förklarar Stachnik. "Ett förlängt exemplar som en biologisk cell rasterskannas med en liten sammanhängande röntgenstråle som producerar många överlappande bilder av delar av provet. Dessa överlappande bilder sys sedan ihop efteråt."

Den tillämpade metoden fungerar utan linser mellan provet och detektorn, och som en följd av detta registreras så kallade röntgendiffraktionsmönster på detektorn. Vart och ett av dessa mönster innehåller information om den rumsliga strukturen för respektive del av provet, som kan beräknas utifrån mönstret. "Detta resulterar slutligen i en helt kvantitativ optisk densitetskarta över provet, " förklarar Stachnik. "Via denna komplexa process, ptykografi ger rumsliga upplösningar bortom de vanliga gränserna för röntgenoptik."

Tack vare dess skanningskaraktär, ptychografi kan kombineras med samtidig förvärv av röntgenfluorescensmätningar som ger ett unikt fingeravtryck av de provbildande elementen. På det här sättet, ett fotografi av provets morfologi som erhållits genom ptykografi kan läggas över med en elementkarta. "Den samtidiga kombinationen av dessa två komplementära avbildningsmetoder möjliggör därför artefaktfria korrelationer av spårelement med det högupplösta provets struktur, " sammanfattar Meents.

En grundläggande förutsättning är att röntgenstrålarna endast är av en enda färg (monokromatisk, alla har samma våglängd) och att de oscillerar i steg (koherent) som i en laser. "Tillräckligt ljusa koherenta monokromatiska röntgenstrålar med tillräckligt höga energier för att låta metaller som järn fluorescera har bara blivit tillgängliga på moderna synkrotronljuskällor som DESYs PETRA III, säger Meents.

För att testa metoden, DESY-forskarna slog sig ihop med gruppen Ulrich Schaible från Research Centre Borstel för att undersöka lokalisering och koncentration av nanobärare för tuberkulosläkemedel i makrofager, immunsystemets asätare celler. "Vanligtvis, makrofager förstör patogener som virus och bakterier. Tyvärr, tuberkulosbakterier har lyckats undvika förstörelse och gömma sig inne i makrofagerna istället, även använda dem för att växa, " säger Schaible. "Som en barriär för effektiv behandling, bakteriernas nischer inom makrofager måste nås med antibiotika för att vara effektiva."

En ny "trojansk häst"-strategi använder nanometerstora järnbehållare för att leverera antibiotika direkt in i cellerna. Dessa behållare är ihåliga, fylld med antibiotika och mäter mindre än 20 nanometer i diameter (en nanometer är en miljondels millimeter). "Makrofager sväljer behållarna, och när de väl är inne i cellen, burarnas järnväggar löses långsamt upp på grund av bakteriernas behov av järn. Så småningom, antibiotika frigörs och dödar bakterierna, " förklarar Schaible.

För att utvärdera effektiviteten av denna strategi, teamet undersökte makrofager som hade matats med järnbehållare. Genom att använda ett speciellt utvecklat skanningssteg vid bioavbildnings- och diffraktionsstrålelinjen P11 av DESYs röntgenkälla PETRA III, forskarna kunde fånga ptykografiska och fluorescensbilder av 14 celler med subcellulär upplösning och identifierade totalt 22 agglomerat av nanocontainrar i dem.

I en andra ansökan slog forskarna sig ihop med gruppen Björn Busse från University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE) och analyserade kalciumhalten i ett prov av mänskligt ben. "Kalcium är ett nyckelelement som gör våra ben starka, " förklarar medförfattaren Katharina Jähn från Busses grupp. "Men, i tider med högt kalciumbehov, kroppen löser upp det från benen för att användas någon annanstans. Dessa och andra åldersrelaterade processer kan leda till osteoporos, drabbar nästan en fjärdedel av alla kvinnor i åldrarna över 50 år i Tyskland."

Experimentell forskning om benmineralisering utförs vanligtvis på små skivor av ben. "Dock, endast det totala innehållet av kalcium kartläggs vanligtvis på detta sätt, " säger Stachnik. "För att få ett riktigt mått på kalciumkoncentrationen, man måste korrigera för provets ofta varierande tjocklek." Teamet använde en samtidigt erhållen ptykografisk bild för att ta bort masstjockleksförvrängningen från kalciumfördelningskartan. "Med detta tillvägagångssätt kunde vi observera en lokalt lägre kalciumhalt kl. vissa punkter i benet, som hjälper till att bättre förstå processen med benstörningar och att kvantifiera effekten av benmineraliseringsförändringar hos patienter, " betonar Stachnik.

För att förbättra metoden ytterligare, forskarna har börjat utöka analysen till tredimensionella mätningar. "Experimentuppställningen utökas för närvarande för att möjliggöra förvärv av 3-D-tomografiska datamängder vid strållinje P11, " säger Meents. "Med många synkrotroner som uppgraderas för att producera ännu ljusare röntgenstrålar, vi förväntar oss att metoden kommer att öka genomströmningen och bli en rutinmässig tillämpning på dessa anläggningar."

Forskningscentrum Borstel, Paul Scherrer-institutet i Schweiz, Karlsruhes tekniska högskola, University Medical Center Hamburg-Eppendorf och DESY var involverade i denna forskning.

DESY är ett av världens ledande partikelacceleratorcenter och undersöker materiens struktur och funktion – från interaktionen mellan små elementarpartiklar och beteendet hos nya nanomaterial och vitala biomolekyler till universums stora mysterier. Partikelacceleratorerna och detektorerna som DESY utvecklar och bygger på sina platser i Hamburg och Zeuthen är unika forskningsverktyg. De genererar den mest intensiva röntgenstrålningen i världen, accelerera partiklar för att registrera energier och öppna nya fönster mot universum. DESY är medlem i Helmholtz Association, Tysklands största vetenskapliga sammanslutning, och får sin finansiering från det tyska förbundsministeriet för utbildning och forskning (BMBF, 90 procent) och de tyska förbundsstaterna Hamburg och Brandenburg (10 procent).