Knutar är oumbärliga verktyg för sådana mänskliga aktiviteter som segling, fiske och bergsklättring, (för att inte tala om, knyta skor). Men att knyta en knut i en spetsliknande DNA-sträng, mäter bara miljarddels meter i längd, kräver tålamod och högt specialiserad expertis.

Hao Yan, en forskare vid ASU, är en övad hand inom detta känsliga och exotiska område, som verkar i korsvägen mellan nanoteknik och konst.

I ny forskning som dyker upp i tidskriften Naturkommunikation , Yan och hans kollegor Fei Zhang, Xiaodong Qi och andra beskriver en metod för att coaxa segment av enkelsträngat DNA till komplexa 2- och 3-D-knutna strukturer.

Resultaten representerar ett viktigt framsteg inom det snabba området DNA-nanoteknik, där livets molekyl används som ett strukturellt byggmaterial för ett stort antal små konfigurationer. Bland dessa finns mycket små robotenheter, fotoniska applikationer, läkemedelstillförselsystem, logiska grindar, såväl som diagnostiska och terapeutiska tillämpningar.

"De knutna DNA-strukturerna som visas i detta arbete uppvisar enastående topologisk komplexitet, långt utöver vad som har uppnåtts före användning av enkelsträngad vikning, " säger Yan. "Ja, det är inte bara häpnadsväckande utan också överraskande att enkelsträngat DNA och RNA kan tränga igenom sina egna kedjor och hitta ett sätt att bilda sådana mycket knutna strukturer, med tanke på att den enda tråden måste väva sig igenom så många härvor."

Yan leder Biodesign Center for Molecular Design and Biomimetics och är Martin D. Glick Distinguished Professor vid School of Molecular Sciences vid ASU.

För in DNA i vecket

Den nya studien involverar innovationer inom området DNA-origami, som, som namnet antyder, använder nukleinsyror som DNA och RNA för att vika och självmontera till komplexa former. Detta inträffar när komplementära nukleotidbaser i DNA:s 4-bokstavs alfabet kommer i kontakt och binder, enligt en strikt regim:C-baser paras alltid med G och A-baser paras alltid med T.

I naturen, strängar av nukleinsyror ger koden som behövs för att göra komplexa proteiner. Denna grundläggande biologi utgör grunden för allt jordeliv. Genom att dra fördel av DNA:s enkla basparningsegenskaper, det är möjligt att designa strukturer som kommer att monteras själv i labbet. Metoden har tillämpats på både enkelsträngade och dubbelsträngade DNA-former, resulterar i nanostrukturer med ökande komplexitet och sofistikering.

Medan DNA-origami har gjort häpnadsväckande framsteg sedan starten, en teknisk innovation har varit oerhört svår att uppnå. Tills nu, att skapa komplexa knutna strukturer i DNA på ett förutsägbart och programmerbart sätt har gäckat forskare.

Det nya verket övervinner detta hinder, fastställa exakta designregler som tillåter enkelsträngade segment av DNA (eller RNA) som sträcker sig från 1800-7500 nukleotider för att bilda knutliknande nanostrukturer med korsande nummer (där DNA-strängen väver in och ut från sin egen längd) från 9 till 57 .

Gruppen visade vidare att dessa nukleinsyrananostrukturer kan replikeras och amplifieras, både under laboratorieförhållanden och inom levande system.

Naturens knutar

Knutna strukturer, som de Yan har tillverkat, (men mycket enklare än de syntetiska), har korrelationer i den naturliga världen. De har observerats i DNA och proteiner och bildas vanligtvis under replikation och transkription, (när en DNA-sekvens kopieras till budbärar-RNA). De kan också förekomma i fagernas genom - virus som infekterar bakterieceller.

Ändå, konstruktionen av molekylära knutar på nanometerskala, att visa väldefinierade och konsekventa geometrier kräver enorm kontroll och precision. När det händer, nukleinsyror som DNA är idealiska för design och syntes av sådana molekylära knutar.

Tidigare, längder av dubbelsträngat DNA har använts för konstruktioner i nanoskala, med tillägg av korta bitar eller "häftsträngar" för att fästa samman resulterande strukturer. Den nya studien använder istället en enda längd av DNA utformad för att svepa runt sig själv i en exakt, förprogrammerad sekvens av steg.

När de knutna DNA-nanostrukturerna lyckats montera sig själva, de avbildas med hjälp av atomkraftsmikroskopi. Noggrann beräkning gör det möjligt för forskarna att optimera vikningsvägarna för att ge det högsta utbytet för varje syntetisk struktur. Användningen av enkel- snarare än dubbelsträngat DNA gör att strukturerna kan produceras i överflöd till mycket lägre kostnad.

Ett enkelsträngat tillvägagångssätt öppnar dörren för design av nanoarkitekturer med specifika, väldefinierade funktioner, som kan produceras genom successiva omgångar av in vitro-evolution, där önskade attribut väljs för i en repetitiv process av förfining. Ytterligare, tillvägagångssättet som beskrivs i den nya studien ger en allmän plattform för design av molekylära strukturer av ökad storlek och oöverträffad komplexitet, banar väg för framsteg inom nanofotonik, drogleverans, cryo-EM-analys och DNA-baserad minneslagring.

Designer-DNA (och RNA)

För en av de första knutdesignerna innebar strategin som Yan och hans kollegor utvecklade, att trä en enda DNA- eller RNA-sträng genom sig själv 9 gånger enligt en förprogrammerad sekvens, demonstrerar att den nya metoden är kapabel att producera intrikata geometriska former som är programmerbara, replikerbar och skalbar.

Designstrategin utökades därefter till att omfatta enkelsträngade RNA-strukturer och 3-D DNA-knutar, vars former rekonstruerades med en teknik som kallas kryogen transmissionselektronmikroskopi, bekräftar deras korrekta vikning till önskade former.

"En av utmaningarna i det här arbetet är hur man kan öka monteringsutbytet av mycket knutna strukturer." Sa Fei. Till skillnad från klassiska DNA-nanostrukturer, de enkelsträngade knutarna är mindre förlåtande när det gäller exakt vikningsordning på grund av den topologiska komplexiteten. Om en enskild korsning viks fel under processen, felet kommer knappast att korrigeras själv och de flesta felveckningarna kommer att finnas kvar i den färdiga strukturen. "Vi utvecklade en hierarkisk vikningsstrategi för att styra den korrekta bildningen av knutar. Vi jämförde vikningseffektiviteten för en knut med 23 korsningar genom att använda olika vikningsvägar. AFM-bilderna visade en dramatisk ökning av vikningsutbytet för välformade strukturer från 0,9 % till 57,9 % genom att tillämpa optimerad hierarkisk vikningsväg." Fei tillade.

Designreglerna som används för att optimera vikningsvägarna är baserade på antalet korsningspunkter, längden på DNA och antalet baspar i den designade strukturen. Tre primära regler fastställdes. Först, linjära vikningsbanor visade sig vara att föredra framför grenade banor. Andra, den utvikta delen av en DNA-sträng bör inte tränga igenom sig själv i de tidiga stadierna när strängen fortfarande är lång. Till sist, kanter av den önskade formen som har tre korsningar ska vikas före de med två korsningar.

Efter designstrategin, teamet kunde skapa mer komplexa DNA-knutar med ökande antal korsningar.

Längre kedjor av enkelsträngat DNA utgör unika utmaningar för att designa programmerade nanostrukturer på grund av den ökade sannolikheten för oavsiktlig självkomplementaritet hos baserna som utgör kedjan. En DNA-knutstruktur som stoltserar med 57 korsade noder som framgångsrikt sammansatts, dock med lägre utbyte och mindre precision. När antalet överfarter ökades till 67, avkastningen sjönk avsevärt och de resulterande strukturerna, bildad av AFM, visade fler monteringsfel.

Studien rapporterar de största DNA-knutarna som hittills har samlats, bildad från upp till 7,5k baser, med de mest komplicerade topologierna, med upp till 57 korsande regioner. De enkelsträngade DNA-sekvenserna kan massproduceras i levande celler för större effektivitet till lägre kostnad. I sista hand, DNA-nanostrukturer med olika funktioner kan bildas i celler, innovationer som ska eftersträvas i framtida arbete.