Ett team av nanobioteknologer vid Harvards Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering och Dana-Farber Cancer Institute (DFCI) ledd av Wyss Founding Core Faculty-medlem William Shih, Ph.D., har utarbetat en programmerbar DNA-självmonteringsstrategi som löser nyckelutmaningen med robust kärnbildningskontroll och banar väg för tillämpningar som ultrakänslig diagnostisk biomarkördetektering och skalbar tillverkning av mikrometerstora strukturer med nanometerstora funktioner.

Med hjälp av metoden, kallad "korsande polymerisation", forskarna kan initiera vävning av nanoband från långsträckta enkla DNA-strängar (kallas "slats") genom en strikt fröberoende kärnbildningshändelse. Studien publiceras i Naturkommunikation .

DNA-nanostrukturer har stor potential för att lösa olika diagnostiska, terapeutisk, och tillverkningsutmaningar på grund av deras höga biokompatibilitet och programmerbarhet. För att fungera effektiva diagnostiska enheter, till exempel, en DNA-nanostruktur kan behöva reagera specifikt på närvaron av en målmolekyl genom att utlösa en förstärkt avläsning som är kompatibel med lågkostnadsinstrument som är tillgängliga i vårdcentraler eller kliniska laboratoriemiljöer.

De flesta DNA-nanostrukturer sätts ihop med en av två huvudstrategier som var och en har sina styrkor och begränsningar. "DNA-origami" bildas av en lång enkelsträngad ställningssträng som stabiliseras i en två- eller tredimensionell konfiguration av ett flertal kortare stapelsträngar. Deras montering är strikt beroende av ställningssträngen, vilket leder till robust allt-eller-inget-vikning. Även om de kan formas med hög renhet under ett brett spektrum av förhållanden, deras maximala storlek är begränsad. "DNA-tegelstenar" å andra sidan kan sätta ihop mycket större strukturer från en mängd korta modulära strängar. Dock, deras montering kräver noggrant kontrollerade miljöförhållanden, kan initieras falskt i frånvaro av ett frö, och producerar en betydande andel ofullständiga strukturer som behöver renas bort.

"Introduktionen av DNA-origami har varit det enskilt mest effektfulla framstegen inom DNA-nanoteknikområdet under de senaste två decennierna. Den korsvisa polymerisationsmetod som vi utvecklade i denna studie bygger på denna och andra grunder för att utöka kontrollerad DNA-självmontering till mycket större längdskalor, sa Shih, som tillsammans leder Wyss' Molecular Robotics Initiative, och är också professor vid Harvard Medical School och DFCI. "Vi föreställer oss att kors och tvärs polymerisation i stort sett kommer att möjliggöra allt-eller-inget-bildning av två- och tredimensionella mikrostrukturer med adresserbara nanoskalaegenskaper, algoritmisk självmontering, och noll-bakgrundssignalförstärkning i diagnostiska applikationer som kräver extrem känslighet."

Plantera ett frö

Efter att ha upplevt begränsningarna hos DNA-origami och DNA-tegelstens nanostrukturer, teamet började med att fråga om det var möjligt att kombinera det absoluta fröberoendet av DNA-origamisammansättning med den gränslösa storleken på DNA-tegelkonstruktioner i en tredje typ av DNA-nanostruktur som växer snabbt och konsekvent till en stor storlek.

"Vi hävdade att allt-eller-inget-sammansättning av DNA-strukturer i mikronskala skulle kunna uppnås genom att designa ett system som har en hög fri energibarriär för spontan sammansättning. Barriären kan bara förbigås med ett frö som binder och arrangerar en uppsättning av "kärnbildande" lameller för gemensam uppfångning av "tillväxt"-lameller. Detta initierar en kedjereaktion av tillväxt-lameller som resulterar i långa DNA-band, " sa medförfattaren Dionis Minev, Ph.D., som är postdoktor i Shihs team.

"Den här typen av mycket samarbetsvilliga, strikt fröberoende kärnbildning följer några av samma principer som styr cytoskelettaktin eller mikrotubulusfilamentinitiering och tillväxt i celler." Förlängningen av cytoskelettfilament följer strikta regler där varje inkommande monomer binder till flera monomerer som tidigare har inkorporerats i polymerfilamentet och i sin tur behövs för bindning av nästa. "Crosscross polymerisation tar denna strategi till nästa nivå genom att göra det möjligt för icke-närmaste grannar att krävas för rekrytering av inkommande monomerer. Den resulterande extrema nivån av koordination är den hemliga såsen, sa Minev.

Från idé till faktiska struktur(er)

Att omsätta sitt koncept i praktiken, teamet designade och validerade ett system där en liten fröstruktur erbjuder en hög startkoncentration av förformade bindningsställen i form av utskjutande enstaka DNA-strängar. Dessa kan detekteras av DNA-lameller med sex (eller i ett alternativt kors och tvärs system åtta) tillgängliga bindningsställen, var och en binder till en av sex (eller åtta) angränsande utskjutande ssDNA-strängar i ett kors och tvärs mönster, och efterföljande DNA-lameller tillsätts sedan kontinuerligt till den förlängande strukturen.

"Vår design är anmärkningsvärd eftersom vi uppnådde snabb tillväxt av enorma DNA-strukturer, ändå med kärnbildningskontroll som är storleksordningar större än andra tillvägagångssätt. Det är som att ha din tårta och äta den också, eftersom vi lätt skapade storskaliga sammanställningar och gjorde det bara där och när vi så önskade, " sa medförfattaren Chris Wintersinger, en Ph.D. student i Shihs grupp som samarbetade i projektet med Minev. "Kontrollen vi uppnådde med kors och tvärs överstiger avsevärt den som observerats för befintliga DNA-metoder där kärnbildning endast kan riktas inom ett smalt fönster av förhållanden där tillväxten är extremt långsam."

Genom att använda kors och tvärs polymerisation, Shihs team genererade DNA-band som självmonterades som ett resultat av en enda specifik sådd till strukturer som mätte upp till tiotals mikrometer i längd, med en massa nästan hundra gånger större än en typisk DNA-origami. Dessutom, genom att utnyttja den höga programmerbarheten hos lamellkonformationer och interaktioner, forskarna skapade band med distinkta svängar och vändningar, vilket resulterar i lindade och rörliknande strukturer.

I framtida studier, detta skulle kunna utnyttjas för att skapa funktionaliserade strukturer som kan dra nytta av rumsligt åtskilda fack. "En omedelbar tillämpning för vår kors och tvärs nanokonstruktionsmetod är som en amplifieringsstrategi i diagnostiska analyser efter bildandet av nanofrön från specifika och sällsynta biomarkörer, " sa medförfattaren Anastasia Ershova, som också är Ph.D. student mentorerad av Shih.

"Utvecklingen av denna nya nanotillverkningsmetod är ett slående exempel på hur Wyss Institutes Molecular Robotics Initiative fortsätter att inspireras av biologiska system, I detta fall, växande cytoskelettfilament, och fortsätter att utöka möjligheterna inom detta spännande område. Detta framsteg för DNA-nanoteknikens potential närmare att lösa akuta diagnostiska utmaningar som det för närvarande inte finns några lösningar för, " sa Wyss grundare Donald Ingber, M.D., Ph.D., som också är Judah Folkman professor i vaskulär biologi vid Harvard Medical School och Boston Children's Hospital, och professor i bioteknik vid Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.