Forskare vid Ludwig Maximilian University (LMU) har utvecklat en innovativ metod för att samtidigt spåra snabba dynamiska processer av flera molekyler i molekylär skala.
Processer i våra kroppar kännetecknas av samspelet mellan olika biomolekyler som proteiner och DNA. Dessa processer sker i en skala ofta inom ett intervall av bara några nanometer. Följaktligen kan de inte observeras med fluorescensmikroskopi, som har en upplösningsgräns på cirka 200 nanometer på grund av diffraktion.
När två färgämnen som markerar positioner för biomolekyler är närmare än denna optiska gräns, kan deras fluorescens inte urskiljas under mikroskopet. Eftersom denna fluorescens används för att lokalisera dem, blir det omöjligt att exakt bestämma deras positioner.
Denna upplösningsgräns har traditionellt övervunnits i superupplösningsmikroskopimetoder genom att få färgämnena att blinka och slå på och av deras fluorescens. Detta separerar deras fluorescens temporärt, vilket gör den urskiljbar och möjliggör lokaliseringar under den klassiska upplösningsgränsen.
Men för tillämpningar som involverar studier av snabba dynamiska processer har detta trick en betydande nackdel:blinkning förhindrar samtidig lokalisering av flera färgämnen. Detta minskar den tidsmässiga upplösningen avsevärt när man undersöker dynamiska processer som involverar flera biomolekyler.
Under ledning av LMU-kemisten professor Philip Tinnefeld och i samarbete med professor Fernando Stefani (Buenos Aires) har forskare vid LMU nu utvecklat pMINFLUX-multiplexering, ett elegant tillvägagångssätt för att ta itu med detta problem.
Teamet har publicerat en artikel om sin metod i tidskriften Nature Photonics .
MINFLUX är en mikroskopimetod med superupplösning, som möjliggör lokaliseringar med precision på bara en nanometer. I motsats till konventionella MINFLUX registrerar pMINFLUX tidsskillnaden mellan exciteringen av färgämnen med en laserpuls och den efterföljande fluorescensen med sub-nanosekundersupplösning.
Förutom att lokalisera färgämnena ger detta insikter i en annan grundläggande egenskap hos deras fluorescens:deras fluorescenslivslängder. Detta beskriver hur lång tid det i genomsnitt tar för en färgämnesmolekyl att fluorescera efter att den har exciterats.
"Livstiden för fluorescens beror på vilket färgämne som används", förklarar Fiona Cole, medförfattare till publikationen. "Vi utnyttjade skillnader i fluorescenslivslängder när vi använde olika färgämnen för att tilldela de fluorescerande fotonerna till färgämnet som emitterade utan att behöva blinka och den resulterande tidsmässiga separationen."
För detta ändamål anpassade forskarna lokaliseringsalgoritmen och inkluderade en multiexponentiell passningsmodell för att uppnå den nödvändiga separationen.
"Detta gjorde det möjligt för oss att bestämma positionen för flera färgämnen samtidigt och undersöka snabba dynamiska processer mellan flera molekyler med nanometerprecision", tillägger Jonas Zähringer, också medförfattare.
Forskarna demonstrerade sin metod genom att noggrant spåra två DNA-strängar när de hoppade mellan olika positioner på en DNA-origaminanostruktur, samt genom att separera translationella och roterande rörelser av en DNA-origaminanostruktur och genom att mäta avståndet mellan antikroppar som binder antikroppar.
"Men det här är bara början", säger Philip Tinnefeld. "Jag är säker på att pMINFLUX multiplexering, med sin höga tidsmässiga och rumsliga upplösning, kommer att ge nya insikter om proteininteraktioner och andra biologiska fenomen i framtiden."
Mer information: Fiona Cole et al, Superupplöst FRET och co-tracking i pMINFLUX, Nature Photonics (2024). DOI:10.1038/s41566-024-01384-4
Journalinformation: Naturfotonik
Tillhandahålls av Ludwig Maximilian University of München
