Western blotting är ett av de vanligaste förfarandena i biokemiska laboratorier. I grunden separerar det proteiner från ett prov efter storlek, sedan testas med hjälp av antikroppar för att bestämma huruvida ett givet protein är närvarande. Det är användbart inte bara i forskning utan även i medicinska eller diagnostiska laboratorier. tester för både HIV och Lyme-sjukdomen involverar exempelvis ett enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) -test, följt av en Western blot om ELISA testar positivt. Trots dess popularitet har Western blotting flera nackdelar.

Nonquantitative

Klassiska västerländska blottar är nonquantitative. Med andra ord, medan de kan berätta för forskare om ett visst protein är närvarande, gör det inte möjligt att kvantifiera hur mycket proteinet är närvarande. Vissa bioteknikföretag säljer nu kit som gör det möjligt för forskare eller labtekniker att kvantifiera mängden protein närvarande med en standardkurva - men detta fungerar bara om rena prov av samma protein finns tillgängliga. Vidare kan molekylvikten av ett protein endast uppskattas med Western blotting, snarare än bestämd exakt som med masspektrometri.

Antikroppar

En Western blot kan endast utföras om primära antikroppar mot protein av intresse är tillgängliga. Medan antikroppar för många olika proteiner finns tillgängliga från bioteknikföretag är de inte billiga. om primära antikroppar inte är tillgängliga för ett givet protein, kommer det inte vara möjligt att utföra en Western blot som letar efter det specifika proteinet. Dessutom kan forskare bestämma om ett protein har modifierats på något sätt - om det har fosforylerats (hade en fosfatgrupp bunden till den) - och med Western blot-tekniken behöver de antikroppar som är specifika för den modifierade protein.

Träning

Det kan vara utmanande att utföra en Western blot korrekt och få bra resultat, så personal måste vara välutbildad. I detta som i mycket annat är erfarenhet kanske den bästa läraren; även för en erfaren tekniker är en Western blot tidskrävande. Gelelektroforesdelen av experimentet, till exempel, tar typiskt från en till två timmar att köra. Andra uppgifter kan utföras medan gelén körs, men experimentet tar fortfarande en tid för att få resultat.

Andra begränsningar

Antikroppar kan ibland uppvisa lite off-target-bindning, vilket kan leda till sämre resultat. Dessutom, med Western blotting, använder du en antikropp mot ett specifikt protein, så dina resultat kommer bara att berätta om proteinet var närvarande. Massuppspektrometri med hög upplösning avslöjar däremot alla proteiner som finns i ett prov, och i motsats till klassisk Western blotting är det kvantitativt. Det är viktigt att komma ihåg att masspektrometri är mycket dyrare och också mer tekniskt utmanande att använda jämfört med Western blotting.