Candida albicans är en ökänd svamppatogen hos människor som orsakar trast och allvarliga systemiska infektioner. Opportunistiska C. albicans svampar, som ofta lever obetydligt i den normala floran hos mänsklig hud och tarm, kan byta från sitt ofarliga smygläge till aggressiva patogener, särskilt hos personer vars immunsystem redan äventyras av redan existerande sjukdomar eller hårda läkemedelsbehandlingar. De kan också bilda biofilm på medicintekniska produkter, såsom katetrar och stentar i människokroppen, som leder till infektioner och ibland dödsfall. Hotet från både fria och biofilmbundna former av patogenen växer ständigt, eftersom virulenta C. albicans -stammar blir alltmer resistenta mot de få läkemedel som finns tillgängliga för att behandla dem.

Mikrobiologer står inför enorma svårigheter i sin strävan att bekämpa C. albicans läkemedelsresistens och bildning av biofilm. Varje C. albicans -mikrob är en "diploid" organism, eftersom den vanligtvis innehåller två kopior av hela dess genom och av alla gener som är kodade inom. Dock, att förstå vilken roll en specifik gen spelar, forskare måste kunna ta bort båda kopiorna samtidigt, låta dem observera effekterna av genens totala frånvaro, vilket har varit en svår utmaning hos C. albicans. Dessutom, gener spelar ofta väldigt lika och ibland överflödiga roller i många processer, inklusive läkemedelsresistens och bildning av biofilm, vilket betyder att mer än en gen måste raderas för att identifiera de gener vars funktioner är länkade.

För att närma sig utmaningen för genradering i C. albicans, ett samarbete som leds av James Collinsand George Church, två Core Faculty -medlemmar vid Harvards Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, har utvecklat en CRISPR-Cas9-baserad "gen drive" -plattform för att skapa diploida stammar av patogenen där båda genkopiorna effektivt kan raderas. Tekniken kan leda vägen mot en bättre förståelse av läkemedelsresistens och biofilmbildande mekanismer, och genom framtida forskning, det kan hjälpa till att hitta nya läkemedelsmål och kombinationsbehandlingar. Studien publiceras i Naturmikrobiologi .

Teamet utnyttjade en nyligen upptäckt mycket sällsynt "haploid" form av C. albicans som, som andra svampar, innehåller bara en uppsättning kromosomer med en kopia av varje gen, men de kan paras för att enkelt skapa den diploida formen. "Vi använde haploida C. albicans -stammar och ersatte gener som vi ville eliminera med en" gendrift "som vi tidigare utvecklat och anpassat till den specifika biologin hos C. albicans. Efter parning, dessa "egoistiska genetiska element" fortsätter att ersätta den normala kopian av genen i diploidsvamparna, "sa kyrkan, Ph.D., som är professor i genetik vid Harvard Medical School och i hälsovetenskap och teknik vid Harvard och MIT. "Tillvägagångssättet fungerade så effektivt att det gjorde att vi till och med kunde ta bort par med olika gener samtidigt med högre genomströmning och undersöka om deras funktioner är relaterade."

Den nya metoden för gendrivning är baserad på CRISPR-Cas9-systemet, där ett DNA-skärande Cas9-enzym riktas mot två regioner som flankerar en gen i haploida C. albicans-svampar av två så kallade guide-RNA (gRNA). Efter att den riktade gensekvensen har klippts ut, en konstruerad gendrivningskassett som uttrycker alla Cas9- och gRNA -komponenter sätts in på plats. När två haploida svampar paras till diploida avkommor, gendriven kommer också att ersätta genens motsvarighet i den andra kromosomen, att helt radera originalversionen från organismen helt.

Genom att tillämpa deras genradering, laget kunde identifiera kombinationer av gener som verkar synergistiskt för att trotsa vissa läkemedel, eller för att utlösa biofilmbildning. "Till exempel, radera antingen de två effluxpumpkodande generna CDR1 och CDR2, eller TPO3 och CDR2 tillsammans, gjort C. albicans mycket känslig för flukonazol och andra svampdödande läkemedel, tyder på att inriktning på två mekanismer samtidigt kan hjälpa till att övervinna läkemedelsresistens, "sa Rebecca Shapiro, Ph.D., en postdoktor i Collins team. Shapiro samarbetade med Alejandro Chavez, Ph.D., som första medförfattare till publikationen. Chavez är en tidigare postdoktor som arbetade med Church och Collins; han är nu assisterande professor vid New York Columbia University. "I biofilmbildningsanalyser, vi fann också att förlusten av ALS3 -vidhäftningsfaktorgenen synergiserar med förlusten av flera andra vidhäftningsfaktorgener, vilket gör det till ett mycket sammankopplat nav för vidhäftning av biofilm och en intressant kandidat att utforska vidare. "

Studien ger nya inslag i att förstå det svåra territoriet för C. albicans patogenes och läkemedelsresistens. "Vi kan nu få ett mycket bättre grepp om hur genetiska nätverk som ligger till grund för virulensen av C. albicans är organiserade, se hur de reagerar på specifika miljö- och läkemedelsstörningar, och därigenom avslöja nya sårbarheter, som i framtiden kan leda till nya läkemedelsmål och kombinationsbehandlingar, "sa Collins, Ph.D., som också är termeerprofessor i medicinsk teknik och vetenskap vid Massachusetts Institute of Technology (MIT) och professor i biologisk teknik vid MIT. "Dessutom, vår plattform för gendrivande array kan vara en plan för liknande tillvägagångssätt i andra svamppatogener, såsom den nyligen framväxande Candida auris, som är mycket läkemedelsresistent och redan har markerats som ett hot av Centers for Disease Control and Prevention. "

"Detta symbiotiska samarbete mellan fakultetsledare för två av Wyss -institutets möjliga teknikplattformar, Jim Collins och George Church, ledde till viktiga nya insikter om biologin hos denna infektiösa svamppatogen och hur den utvecklar resistens, förutom att öppna en helt ny väg för design av effektivare svampdödande behandlingar, "sade Wyss Institute grundande direktör Donald Ingber, M.D., Ph.D., som också är Judah Folkman professor i vaskulär biologi vid HMS och Vascular Biology Program på Boston Children's Hospital, samt professor i bioingenjör vid SEAS.