Polymeraskedjereaktion, eller PCR, är en teknik som kopierar ett fragment av DNA till många fragment - exponentiellt många. Det första steget är att PCR är att värma DNA så att det denaturerar eller smälter i enkla strängar. DNA-strukturen är som en repstege där spåren är rep med magnetiska ändar. Magneterna ansluter för att bilda spåren, som kallas baspar, och därigenom motstå att dras från varandra. Varje fragment av DNA smälter i enskilda strängar vid olika temperaturer. Förstå hur DNA-strukturen hålls samman av DNA: s enskilda delar kommer att ge insikt om varför olika DNA-fragment smälter vid olika temperaturer och varför sådana höga temperaturer behövs i första hand.
Smältning! Smältning!
Det första steget med PCR är att smälta DNA så att dubbelsträngat DNA separeras i enkelsträngat DNA. För däggdjurs-DNA innefattar detta första steg vanligtvis värme av ungefär 95 grader Celcius (cirka 200 Fahrenheit). Vid denna temperatur bryts vätebindningarna mellan A-T- och G-C-basparen eller spåren i DNA-stegen, separering av dubbelsträngat DNA. Temperaturen är emellertid inte tillräckligt varm för att bryta fosfat-sockerhuvudet som bildar de enskilda strängarna eller stegen på polen. Komplett separation av enskilda strängar förbereder dem för det andra steget av PCR, som kyler för att tillåta korta DNA-fragment, som kallas primers, för att binda de enskilda strängarna.
Magnetisk blixtlås
En orsak DNA är uppvärmd till hög temperatur på 95 grader Celcius är att ju längre DNA-dubbelsträngen är desto mer vill den stanna tillsammans. DNA-längd är en faktor som påverkar smältpunkten som valts för PCR på den DNA-delen. A-T- och G-C-basen parar i dubbelsträngad DNA-bindning med varandra för att hålla dubbelsträngstrukturen tillsammans. De mer konsekutiva basparen mellan två ensträngar har bundet, ju mer deras grannar också vill binda, och ju starkare attraktionen mellan de två strängarna blir. Det är som en dragkedja tillverkad av små magneter. När du stänger dragkedjan, kommer magneterna naturligtvis att glida upp och hålla blixtlås.
Starkare magneter Stick mer hårt
En annan faktor som påverkar vilken smältpunkt som ska väljas för ditt DNA-fragment av intresse är mängden GC baspar närvarande i det fragmentet. Varje baspar är som två mini-magneter som lockar. Ett par av G och C lockas mycket starkare än ett A- och T-par. Således kommer en bit DNA som har mer G-C-par än ett annat fragment att kräva en högre temperatur innan de smälter in i enstaka strängar. DNA absorberar naturligt ultraviolett ljus - vid 260 nanometer våglängden, att vara exakt - och enkelsträngat DNA absorberar mer ljus än dubbelsträngat DNA. Så mäta mängden ljus som absorberas är ett sätt att mäta hur mycket ditt dubbelsträngade DNA har smält i enstaka strängar. Den "magnetiska blixten" -effekten av G-C och A-T-baspar är vad som orsakar ett diagram över ljusabsorbansen hos dubbelsträngat DNA ritat mot en temperaturökning som är sigmoidal, formad som en S och inte en rak linje. S-kurvan representerar det sammansatta motståndet som basparen utövar mot värmen eftersom de inte vill skilja.
Halvvägspunkten
Temperaturen vid vilken en DNA-längd smälter i enkla strängar kallas dess smältpunkt, som betecknas med förkortningen "Tm." Detta indikerar temperaturen vid vilken hälften av DNA i en lösning har smält i enstaka strängar och den andra halvan fortfarande är i dubbelsträngig form. Smältemperaturen är olika för varje fragment av DNA. Mammalian-DNA har ett G-C-halt av 40%, vilket innebär att de återstående 60% av basparen är As och Ts. Dess 40% G-C-innehåll gör att däggdjurs DNA smälter vid 87 grader Celcius (ca 189 Fahrenheit). Därför är det första steget med PCR på däggdjurs DNA att värma den till 94 grader Celcius (201 Fahrenheit). Bara sju grader varmare än smälttemperaturen och alla dubbla trådar smälter helt till enkla trådar.
