Molekylär modell som visar dCas9 bundet till en guide RNA-RNA origami fusionsmolekyl som för transkriptionsfaktorer till en promotorsekvens. Kredit:Cody Geary, Aarhus Universitet
Att utveckla verktyg för exakt kontroll av biologiska processer har varit en av huvudpelarna i det nu mogna området syntetisk biologi. Dessa vetenskapliga verktyg lånar principer från en mängd forskningsfält som, när de kombineras, möjliggör unika tillämpningar som är potentiellt transformerande för det moderna samhället.
Att översätta moderna RNA-nanoteknologiska innovationer i det biologiska sammanhanget har en enorm potential på grund av kompatibilitet med veckning och uttryck i celler, men det medför också unika utmaningar såsom snäva prestationsvillkor och inneboende instabilitet hos RNA-molekyler.
Men en ny strukturell RNA-designmetod som utvecklats i Andersen-labbet, kallad "RNA-origami", försöker ta itu med detta. Detta tillvägagångssätt försöker generera komplexa konstgjorda RNA-baserade enheter som är stabila i celler, interagerar med andra biomolekyler, inklusive andra RNA och proteiner, och möjliggör unika tillämpningar, särskilt i samband med genreglering.
Demonstreras av två distinkta tillvägagångssätt nyligen publicerade i Nucleic Acids Research RNA-origami presenteras som en sofistikerad RNA-designplattform som, när den tillämpas i det cellulära sammanhanget, genererar unika molekyler för syntetisk biologibaserad reglering.
Ett mRNA med operatorer hämmas av proteinerna de uttrycker. RNA-origamimolekyler fungerar som svampar som binder proteinerna och gör mRNA:n translationellt aktiva igen. Kredit:ACS Synthetic Biology (2022)
RNA-svampar reglerar enzymproduktionen i bakterier
I det första tillvägagångssättet användes RNA-origami för att uppnå exakt kontroll av proteinproduktionsnivåer när det uttrycks i bakterier. Självinhiberande proteinuttryckskassetter gjordes genom att installera ett starkt bindningsställe för det uttryckta proteinet i sin egen gen. Efteråt uttrycktes RNA-origami dekorerad med samma proteinbindningsställen i stort överskott.
På detta sätt fungerar RNA-origami som en proteinsvamp som binder proteiner i cellen och tillåter uttryck av det självhämmande proteinet. Detta allmänna koncept visade sig möjliggöra reglering av flera proteiner samtidigt och aktivera enzymatiska vägar för förbättrade produktutbyten.
CRISPR-dCas9 fungerar som en masterregulator för sgRNA – RNA-origamifusionsmolekyler som för transkriptionsfaktorer till en promotorsekvens. Grafik av George Pothoulakis. Kredit:Nucleic Acids Research (2022). DOI:10.1093/nar/gkac470
CRISPR-baserade regulatorer för jästkemiska fabriker
I det andra tillvägagångssättet kombinerades RNA-origami med CRISPR, en av de mest populära moderna molekylärbiologiska teknikerna, för att reglera genuttryck i jäst. RNA-origamis integrerades i de små RNA som styr CRISPR-Cas9 för att rikta specifika sekvenser i DNA-genomet.
RNA-origamiställningarna dekorerades med proteinbindande ställen som kunde rekrytera transkriptionsfaktorer. Genom att rikta RNA-ställningarna till promotorregioner aktiverade transkriptionsfaktorerna genuttryck. Det visades att uttrycksstyrkan kan justeras av ställningens orientering och mängden transkriptionsfaktorer som rekryteras. Slutligen visades det att multienzymvägar kunde kontrolleras för högutbyte av läkemedlet violacein mot cancer. + Utforska vidare
