Den nya cellfria proteinkristallisationsmetoden (CFPC) som utvecklats av Tokyo Tech inkluderar direkt proteinkristallisering och är ett stort framsteg inom området strukturbiologi. Denna teknik kommer att möjliggöra analys av instabila proteiner som inte kunde studeras med konventionella metoder. Att analysera dessa kommer att öka vår kunskap om cellulära processer och funktioner.

Även om vi är bekanta med vissa kristaller som salt och socker som vi använder i våra vardagliga liv, finns det en annan uppsättning kristaller, dolda för blotta ögat, som är avgörande för vår biologi. Mikroskopiska proteinkristaller finns i levande celler och hjälper till att upprätthålla processer som immunsystemaktivering, proteinlagring och skydd.

För att bättre förstå sambandet mellan proteinkristallers struktur och funktion utvecklade forskare metoden in-cell protein crystallization (ICPC), som direkt kan observera proteinkristaller i levande celler, vilket säkerställer högkvalitativa kristaller utan behov av reningsprocesser eller komplex screening metoder. Men trots dess många fördelar rapporterades väldigt få strukturer eftersom kristallerna som bildades i levande celler inte hade den storlek och kvalitet som krävdes för analys. Så ett team av forskare från Japan, ledd av prof. Takafumi Ueno från Tokyo Tech, hade som mål att utveckla en bättre metod. Och nyligen fick de ett genombrott.

I deras artikel publicerad i Scientific Reports , rapporterade laget utvecklingen av en teknik som skulle göra proteinkristallisering och analys mer effektiv och effektiv. Denna teknik – en cellfri proteinkristallisationsmetod (CFPC) – var en hybrid mellan in vitro proteinkristallisation och ICPC, och tillät snabb och direkt bildning av proteinkristaller utan behov av komplicerade kristalliserings- och reningsmetoder.

"ICPC förväntas bli ett viktigt verktyg i kristallstrukturanalys men vi behöver en metod för att få bättre upplösning av proteinkristallstrukturer. Så vi fokuserade på att etablera högkvalitativ proteinkristallisation med hjälp av CFPC med småskaliga och snabba reaktioner", säger prof. Ueno, som också leder Ueno-laboratoriet vid Tokyo Tech. Medlemmar i detta labb studerar naturligt förekommande proteinsammansättningar, deras struktur och funktioner, i syfte att tillämpa denna kunskap för att utveckla innovativa bioteknik- och energilösningar.

För att komma tillbaka till teamet som genomför den aktuella studien (av vilka några också är medlemmar i Ueno-laboratoriet), använde de ett kit för syntes av vetegroddsprotein, som är ett verktyg för syntes av polyhedrinmonomer, ett viralt protein som produceras i insektsceller av cypovirusinfektion. Detta protein kristalliserades sedan med den nya CFPC-metoden, vilket ledde till bildandet av nanostora polyhedrakristaller (PhC). Teamet kunde effektivt slutföra denna process inom sex timmar, med endast 20 mikroliter av reaktionsblandningen.

Svepelektronmikroskopbilder indikerade att PhCs hade utmärkt renhet, vilket möjliggjorde bestämning av deras struktur vid en upplösning så hög som 1,95 Å (eller 1,95 Ångström). För att ytterligare utforska kapaciteten hos deras nya system, genomförde teamet den strukturella analysen av kristallint inklusionsprotein A (CipA). Dess struktur bestämdes vid en hög upplösning på 2,11 Å, något som aldrig hade rapporterats före denna studie.

Detta arbete är ett stort steg framåt inom området strukturell biologi eftersom den metod som föreslås kommer att möjliggöra analys av instabila och lågavkastande proteiner som inte kan studeras med konventionella metoder. Denna teknologi syftar också till att hjälpa till i utvecklingen av avancerade tekniker för småskalig och snabb proteinkristallisering och analys. "De högkvalitativa proteinkristallerna som produceras av vår metod kommer att utöka horisonterna för strukturell bestämning och ge oss användbara och oöverträffade insikter i den komplexa miljön av levande celler", säger prof Ueno. + Utforska vidare

In-cell nano-3D-skrivare:Syntetiserar stabila filament från cellproteinkristaller