Sedan deras upptäckt har forskare upprepade gånger visat de potentiella medicinska tillämpningarna av differentierade celler och vävnader som genereras från inducerade pluripotenta stamceller (iPS). Ett betydande hinder för verkliga medicinska tillämpningar är emellertid relaterat till substratet som används för att odla och inducera iPS-celler till differentierade celltyper.
I synnerhet, även om differentieringsprotokoll som genererar myocyter och muskelstamceller (MuSC) från iPS-celler har rapporterats, förblir de relativt låga i effektivitet och kräver användning av ett populärt djurhärlett substrat som kallas Matrigel.
För att gå framåt är effektivare induktionsprotokoll och en övergång mot xenofria (utan animaliska produkter) substrat som kan säkerställa kostnadseffektivitet, reproducerbarhet och säkerhet nödvändiga.
För detta ändamål har ett samarbetsteam från Japan kombinerat sin expertis för att designa och validera ett nytt rekombinant extracellulärt matrisprotein, kallat new generation laminin fragments (NGLFs), för differentiering av iPS-celler till muskelcellslinjer.
Resultaten av denna studie publicerades i Advanced Science den 29 april 2024.
Tidigare studier har etablerat rekombinanta laminin E8 (LM-E8)-fragment som ett minimalt substrat för iPS-cellkulturer, men de stöder inte myogen differentiering. För att identifiera en LM-E8-variant som kan stödja myocyt- och MuSC-generering från iPS-celler, testade teamet olika lamininer med olika sammansättning men fann att de endast stödde drastiskt lägre nivåer av myogen differentiering.
Forskarna resonerade att perlecan, en multifunktionell heparansulfat proteoglykan (HSPG) kärna med flera heparansulfatkedjor i Matrigel, kan vara avgörande för dess förmåga att stödja olika molekylära interaktioner som är nödvändiga för optimalt underhåll och differentiering av iPS-celler och designade därför en LM-E8 fäst. till perlecan-domän 1 med tre HS-kedjor (D1-HS).
Forskarna observerade betydande förbättringar i myogen differentiering genom att fästa denna modifiering till C-terminalen av LM-E8-varianter. Särskilt p421-isoformen visade den bästa förbättringen, till och med bättre än Matrigel, så forskarna fokuserade på att använda denna isoform för att generera myocyter och MuSCs.
Genom att undersöka differentieringsmarkörer i olika stadier (d.v.s. primitiv streak (PS), paraxial mesoderm (PM) och dermomyotom (DM)), bekräftade forskargruppen att inte bara NGLF:er är överlägsna motsvarande LM-E8-varianter när det gäller att främja stadiespecifika markörgenuttryck, p421 stödjer konsekvent bättre differentiering än någon annan testade NGLF.
Särskilt fann forskarna att p421 specifikt stöder differentiering till PM-stadiet, eftersom inga gynnsamma effekter observerades från p421 efter PM-bildning. Dessutom, genom att använda heparitinas (för att bryta ned HS-kedjor) och surfen (för att hämma HS-medierade interaktioner), härledde de de fördelaktiga effekterna av p421 för att härröra främst från HS-delen.
Dessutom, genom att blockera flera signalreceptorer och deras nedströms intracellulära effektorer, bestämde de att p421 huvudsakligen fungerar genom bFGF-FGFR-EGF-vägen för att främja PM-induktion. Genuttrycksanalys visade vidare att denna signalering stödde HOX-genuttryck för att främja odifferentierade iPS-celler mot PS-stadiet.
För att visa vikten av konjugationsorientering mellan LM-E8 och D1-HS genererade forskarna p421-varianter genom att fästa HS-delen till den N-terminala änden av β- eller γ-kedjan av LM-E8. Även om dessa varianter ökade stegspecifika markörgenuttryck, visade p421 betydligt starkare effekter i jämförelse.
Från dessa fynd drog forskargruppen slutsatsen att p421 sannolikt underlättar FGFR-signalering genom att föra HS-bundna FGF närmare cellytan för att främja FGFR-dimerisering.
Slutligen, för att illustrera hur p421 förbättrar myogen differentiering och övervinner inkonsekvenser som plågar nuvarande induktionsprotokoll, genererade forskargruppen sjukdoms- och kontroll-iPS-cellinjer för två former av muskeldystrofi, Duchene muskeldystrofi (DMD) och Miyoshi-myopati (MM).
Som förväntat stödde p421 kraftigt förbättrad myogen differentiering från alla undersökta iPS-cellinjer. Dessutom fann forskarna att p421 förbättrade myogen differentiering över flera vanligt använda odlingsmedier.
Sammanfattningsvis skapade forskargruppen framgångsrikt ett rekombinant proteoglykansubstrat som stödjer betydande förbättringar av myogen differentiering och demonstrerade dess underliggande mekanism.
Förhoppningen är att NGLF:er kommer att hjälpa till att etablera högeffektiva, xenofria differentieringsprotokoll för att generera iPS-cellhärledda muskelcellslinjer för medicinska tillämpningar mot olika myopatier.
Mer information: Mingming Zhao et al, Heparan Sulfate Chain-Conjugated Laminin-E8 Fragments Advance Paraxial Mesodermal differentiation följt av hög myogen induktion från hiPSCs, Advanced Science (2024). DOI:10.1002/advs.202308306
Journalinformation: Avancerad vetenskap
Tillhandahålls av Kyoto University
