Det är möjligt att klona hela organismer som fåren Dolly, men DNA-kloning är annorlunda. Den använder molekylärbiologitekniker för att göra identiska kopior av DNA-sekvenser eller enstaka gener.

Med hjälp av gentekniska metoder identifieras och isoleras segment av DNA-genetiska koden. DNA-kloning kopierar sedan nukleinsyrasekvenserna i segmenten.

De resulterande identiska kopiorna kan användas för ytterligare forskning eller för biotekniska applikationer. Ofta kodar genen som kopieras för ett protein som kan ingå i medicinska behandlingar. DNA-teknik inklusive DNA-kloning stöder förståelsen för hur gener fungerar och hur den genetiska koden för människor påverkar kroppens funktion. DNA-kloning: Definition och processöversikt.

DNA-kloning är molekylärbiologiprocessen att göra identiska kopior av DNA-segment belägna i kromosomerna som innehåller den genetiska koden för avancerade organismer.

Processen genererar stora mängder av mål-DNA-sekvenserna
. Syftet med DNA-kloning är att producera mål-DNA-sekvenserna själva eller att producera de proteiner som kodas i målsekvenserna.

De två metoderna som används i DNA-kloning kallas plasmidvektor
och Polymeraskedjereaktion (PCR)
. I plasmidvektormetoden skärs DNA-strängar med hjälp av restriktionsenzymer
för att producera DNA-fragment, och de resulterande segmenten införs i kloningsvektorer som kallas plasmider för ytterligare duplikering. Plasmiderna placeras i bakterieceller som sedan producerar DNA-kopior eller kodade proteiner.

I PCR-metoden markeras segmentet av DNA-strängar som ska dupliceras med enzymer som kallas primers
. Ett polymerasenzym gör kopior av den markerade delen av DNA-strängen. Denna metod använder inte restriktionsenzymer och kan producera klonat DNA från små prover. Ibland används de två DNA-teknologimetoderna tillsammans för att integrera de bästa egenskaperna hos var och en i en total reaktion.
Plasmid Vector Method -

Metodens vektor hänvisar till plasmiden som används för att hålla DNA-segmentet i mål att klonas. Plasmider är små cirkulära strängar av icke-kromosomalt DNA och finns i många organismer inklusive bakterier och virus.

Bakteriella plasmider är den vektor som används för att införa mål-DNA-segmentet i bakterieceller för ytterligare duplikering.

Välja och isolera mål-DNA: Innan DNA-kloningsprocessen kan börja måste DNA-sekvenserna identifieras, särskilt början och ändarna på DNA-segmenten.

Sådana DNA-sekvenser kan hittas genom att använda befintligt klonat DNA med kända sekvenser eller genom att studera proteinet producerat av mål-DNA-sekvensen. När väl sekvensen är känd kan motsvarande restriktionsenzymer användas.

Skär mål-DNA med restriktionsenzymer: Restriktionsenzymer väljs för att leta efter DNA-koden i början och slutet av målsekvenserna.

När restriktionsenzymerna hittar en speciell kodad sekvens av baspar som kallas restriktionsställen, fäster de sig vid DNA på den platsen och lindar sig runt DNA-molekylen och skär strängen. De skurna DNA-segmenten som innehåller målsekvensen är nu tillgängliga för duplikering.

Välja plasmidvektorn och infoga måladNA: En lämplig plasmid innehåller idealiskt samma DNA-kodande sekvenser som DNA-strängen från vilken mål-DNA: n var skära. Den cirkulära DNA-strängen hos plasmiden skärs med samma restriktionsenzymer som användes för skärning av mål-DNA.

Ett DNA-ligasenzym
används för att främja DNA-segmentlänkning, och ändarna av mål-DNA-segmentet kopplas upp med de snittade ändarna av plasmid-DNA. Mål-DNA-numret utgör nu en del av den cirkulära plasmid-DNA-strängen.

Insättning av plasmiden i en bakteriecell: När plasmiden innehåller den DNA-sekvens som ska klonas kan den faktiska kloningen äga rum med en process som heter bakterietransformation
. Plasmiderna sätts in i en bakteriecell såsom E. coli, och cellerna med de nya DNA-segmenten kommer att börja producera kopior och motsvarande proteiner.

Vid bakterietransformation inkuberas värdcellerna och plasmiderna tillsammans vid kroppstemperatur i cirka 12 timmar. Cellerna absorberar några av plasmiderna och behandlar dem som deras egna plasmid-DNA.

Skörda det klonade DNA och proteiner: De flesta plasmider som används för DNA-kloning har antibiotikaresistensgener som ingår i deras DNA. När bakteriecellerna absorberar de nya plasmiderna blir de resistenta mot antibiotika.

När kulturen behandlas med antibiotika överlever bara de celler som har absorberat de nya plasmiderna. Resultatet är en ren kultur av bakterieceller med klonat DNA. Det DNA kan sedan skördas eller motsvarande protein kan produceras.
PCR (Polymerase Chain Reaction) -metod

PCR-metoden är enklare och kopierar befintligt DNA på plats. Det kräver inte skärning med restriktionsenzymer eller insättning av plasmid-DNA-sekvenser. Detta gör det särskilt lämpligt för kloning av DNA-prover med ett begränsat antal DNA-strängar. Medan metoden kan klona DNA kan den inte användas för produktion av motsvarande protein.

Uppspolning av DNA-strängarna: DNA i kromosomer är tätt spiralformad i en dubbel spiralstruktur. Uppvärmning av DNA till 96 grader Celsius i en process som kallas denaturering och gör att DNA-molekylen rullas upp och separeras i två strängar. Denna separering krävs eftersom endast en enda DNA-sträng kan klonas samtidigt.

Val av primrar: Liksom med plasmidvektor-DNA-kloning måste DNA-sekvenserna som ska klonas identifieras med särskild tonvikt på början och slut på DNA-segmenten. Primers är enzymer som binder till specifika DNA-kodsekvenser, och de måste väljas för att markera mål-DNA-segmenten. De rätta primrarna kommer att fästas vid DNA-molekylsekvenserna för att markera början och ändarna av målsegmenten.

Annealing av reaktionen för att binda primers: Kylning av reaktionen till cirka 55 grader Celsius kallas glödgning
. När reaktionen svalnar aktiveras primrarna och fäster sig vid DNA-strängen i varje ände av ett mål-DNA-segment. Grunderna fungerar endast som markörer, och DNA-strängen behöver inte skäras.

Producerar identiska kopior av mål-DNA-segmentet: I en process som kallas förlängning
, den värmekänsliga TAQ polymerasenzym sättes till reaktionen. Reaktionen upphettas sedan till 72 grader Celsius, vilket aktiverar enzymet. Det aktiva DNA-polymerasenzymet binder till primrarna och kopierar DNA-sekvensen mellan dem. Den initiala DNA-sekvenserings- och kloningsprocessen är klar.

Öka utbytet av klonat DNA: Den initiala glödgnings- och förlängningsprocessen skapar relativt få kopior av tillgängliga DNA-strängsegment. För att öka utbytet genom ytterligare DNA-replikering kyls reaktionen igen för att återaktivera primrarna och låta dem binda till andra DNA-strängar.

Därefter aktiverar reaktionsreaktionen polymerasenzym igen och fler kopior produceras. Denna cykel kan upprepas 25 till 30 gånger.
Använda plasmidvektor- och PCR-DNA-kloningsmetoder tillsammans.

Plasmidvektormetoden förlitar sig på en riklig initial tillförsel av DNA för att skära och infoga i plasmider. För lite originalt DNA resulterar i färre plasmider och en långsam start på klonad DNA-produktion.

PCR-metoden kan producera en stor mängd DNA från få ursprungliga DNA-strängar, men eftersom DNA inte implanteras i en bakteriecell , proteinproduktion är inte möjlig.

För att producera proteinet kodat i DNA-fragmenten som ska klonas från ett litet initialt DNA-prov kan de två metoderna användas tillsammans och de kan komplettera varandra. Först används PCR-metoden för att klona DNA från ett litet prov och producera många kopior.

Sedan används PCR-produkterna med plasmidvektormetoden för att implantera det producerade DNA i bakterieceller som producerar det önskade proteinet.
Exempel på DNA-kloning för bioteknik