1. Att få den mänskliga genen av intresse
* isolering från humant DNA: Den önskade humana genen extraheras från humana celler med användning av tekniker som restriktionsenzym -matsmältning eller PCR (polymeraskedjereaktion).
* Syntes: Genen kan också syntetiseras artificiellt med användning av gensyntessteknik, vilket ofta är mer effektivt för komplexa gener.
2. Förbereda plasmidvektorn
* plasmidval: En lämplig plasmidvektor väljs, ofta en med flera kloningsplatser (MCS), antibiotikaresistensgener och andra funktioner som underlättar kloning.
* Restriktionsenzym matsmältning: Plasmiden skärs upp på specifika platser med användning av restriktionsenzymer, vilket skapar "klibbiga ändar" som är kompatibla med den mänskliga genen.
3. Ligering (sammanfogning) av genen och plasmiden
* Kompatibilitet: De klibbiga ändarna av den mänskliga genen och den lineariserade plasmiden är utformade för att vara kompatibla, vilket gör att de kan binda samman genom kompletterande basparning.
* ligasenzym: DNA -ligas används för att katalysera bildningen av fosfodiesterbindningar och permanent förenade den humana genen i plasmiden.
4. Omvandling till bakterier
* kompetenta celler: Bakterieceller görs "kompetenta" för att ta upp DNA med olika metoder, såsom värmechock eller elektroporering.
* Introduktion: De rekombinanta plasmiderna införs i de kompetenta bakterierna.
* val: Bakterier som framgångsrikt har tagit upp plasmiden väljs genom att odla dem på media som innehåller antibiotika. Endast bakterier med plasmiden kommer att växa på grund av antibiotikaresistensgenen.
5. Verifiering och bekräftelse
* Colony PCR: PCR används för att bekräfta närvaron av den mänskliga genen inom bakteriekolonierna.
* Sekvensering: Den infogade gensekvensen verifieras genom DNA -sekvensering för att säkerställa att den är korrekt och intakt.
Nyckelkomponenter och överväganden:
* Begränsningsenzymer: Dessa enzymer skär DNA vid specifika sekvenser, vilket skapar kompatibla ändar för ligering.
* DNA -ligas: Detta enzym förenar ändarna på DNA -strängar tillsammans.
* Antibiotikaresistensmarkörer: Dessa gener på plasmiden möjliggör val av bakterier som framgångsrikt har införlivat plasmiden.
* MCS (flera kloningsplatser): Denna region av plasmiden innehåller flera restriktionsenzymplatser, vilket möjliggör införandet av olika gener.
Varför är detta viktigt?
* Produktion av proteiner: Rekombinanta bakterier kan användas för att producera stora mängder humana proteiner, såsom insulin eller tillväxthormon, för terapeutiska ändamål.
* Forskningsverktyg: Rekombinanta plasmider är viktiga för genkloning och genuttrycksstudier.
* genterapi: I vissa fall kan rekombinanta plasmider som innehåller terapeutiska gener användas för att leverera korrigerande gener till celler i genterapi.
Obs: De specifika detaljerna i processen kan variera beroende på genen som klonas, bakterievärden och den önskade applikationen.
