Tatomm/iStock/GettyImages
Att bestämma koncentrationen av celler i ett flytande prov är en rutinmässig men ändå viktig uppgift i kliniska laboratorier och forskningslaboratorier. Noggranna cellantal informerar läkare om en patients immunstatus, hjälper till att diagnostisera infektioner och vägleder fertilitetsbedömningar. I forskning gör de det möjligt för forskare att kvantifiera bakterier, jästsvampar och andra mikroorganismer för ekologiska studier eller industriella processer. Den vanligaste, tillförlitliga metoden för cellräkning är hemocytometern, en exakt räknekammare som lärs ut i biologikurser och används i professionella laboratorier över hela världen.
När en cellsuspension innehåller miljontals celler blir direkt räkning opraktisk eftersom celler överlappar varandra och inte kan särskiljas. För att uppnå en lämplig utspädning, överför 10 µL av den ursprungliga lösningen till ett sterilt provrör som innehåller 90 µL av ett lämpligt utspädningsmedel (t.ex. fosfatbuffrad saltlösning eller odlingsmedium). Blanda noggrant; detta skapar en tiofaldig utspädning (spädningsfaktor=10⁻¹). Märk röret och upprepa proceduren tills provet är tillräckligt utspätt för korrekt räkning. Varje ytterligare tiofaldig utspädning multiplicerar utspädningsfaktorn med 10 (t.ex. ger en andra utspädning 10⁻², en tredje 10⁻³).
Hemocytometern är en liten, klar kammare med ett rutnät etsat på dess bottenyta. Dess djup är vanligtvis 0,1 mm, och rutnätet är uppdelat i stora och små kvadrater vars ytor är 1 mm² respektive 0,04 mm². Pipettera en liten volym av den utspädda suspensionen i kammarens brunn. Kapillärverkan sprider vätskan över gallret. Placera kammaren på ett mikroskopbord och titta på den med låg förstoring (×10–×40).
Välj ett bekvämt mönster av rutor - vanligtvis de fyra hörnen och en central fyrkant - för att räkna minst 100 celler. För stora celler, använd de större rutorna; för mindre celler, räkna de mindre kvadraterna. Anteckna antalet celler i varje vald ruta.
Varje stor kvadrat har en volym på 0,1 mm³ (0,1 mm×1 mm²). Om du räknade 103 celler över fem stora rutor, är den totala räknade volymen 0,5 mm³. Fördubbling av denna volym för att representera hela 1 mm³ ger 206 celler. Eftersom 1 ml är lika med 1 cm³ och innehåller 1 000 mm³, är koncentrationen i det utspädda provet:
Formel:Volym av räknad area×antal kvadrater =total räknad volym
Celler ÷ total räknad volym =celler per mm³
celler per mm³×1 000 =celler per ml
Justera för utspädningsfaktorn som används under beredningen. För en utspädningsfaktor på 10⁻² (dvs. 1:100) är den ursprungliga provkoncentrationen:
Således innehöll den initiala outspädda suspensionen cirka 20,6 miljoner celler per milliliter.
