Jonkanaler i membranblåsorna som förmedlar intracellulär proteintransport spelar en avgörande roll i cellfysiologin. En metod som utvecklats av ett Ludwig-Maximilians-Universitaet (LMU) i München-teamet gör nu att de kan studeras med större specificitet än någonsin tidigare.

Små membranbundna vesiklar, känd som endosomer och lysosomer, fungera som fordon för transport av proteinlaster inom djurceller. Inbäddade i vesikelmembranen är proteiner som kallas jonkanaler, som styr passagen av elektriskt laddade atompartiklar ('joner') in i och ut ur dessa intracellulära organeller. Defekter i dessa proteiner spelar en central roll i patogenesen av många sjukdomar, och dissektion av deras molekylära funktioner är avgörande för utvecklingen av effektiva terapier för dessa störningar. PD Christian Grimm och professor Christian Wahl-Schott vid farmaceutiska institutionen (direktör:professor Martin Biel) vid LMU München är bland Europas ledande specialister på användning av den så kallade patch-clamp-tekniken för studier av jonkanaler i cellmembran . I det senaste numret av tidningen Naturprotokoll , de beskriver hur de har anpassat metoden för användning med endolysosomala vesiklar. I en andra studie, publicerad i tidskriften Cell Chemical Biology, de visar på hur patchklämning kan appliceras på specifika funktionella klasser av transportvesiklar. Detta genombrott öppnar helt nya perspektiv för karakterisering av jonkanaler och mekanismerna som reglerar dem.

Det endolysosomala systemet består av tre olika klasser av endosomer - tidigt, sena och återvinnande endosomer - liksom lysosomer. Dessa olika typer av vesiklar har olika funktioner. Tidiga endosomala vesiklar bildas genom infällning av fläckar i cellmembranet som svar på aktivering av t.ex. receptorproteiner av extracellulära signalmolekyler. Detta gör att receptorerna kan avlägsnas från ytan och lossas från deras aktiverande ligander. Receptorerna överförs sedan antingen till återvinningsendosomer och återförs till cellmembranet, eller levereras till sena endosomer som förmedlar dem till lysosomer, där de bryts ned enzymatiskt. Detta människosmugglingssystem deltar i många metaboliska processer och spelar en viktig roll för reglering av tungmetallmetabolism och för korrekt lokalisering av specifika membranreceptorer. Jonkanalerna som finns i vesikulära membran är intimt involverade i alla dessa operationer. "Enligt studier av deras proteinpopulationer, lysosomer och endosomer innehåller upp till 70 distinkta jonkanalstransportproteiner, "Säger Grimm.

Med patch-clamp-metoden kan man mäta passagen av laddade partiklar genom enstaka jonkanaler i membranplåster, och därmed för att avgöra om kanalen är aktiv eller inaktiv. Att göra så, en drar en liten bit membran in i en mikropipett genom att applicera svagt sug, sålunda säkerställs att en tät tätning bildas mellan membranet och pipettens vägg. Med hjälp av en mikroelektrod, man kan sedan applicera en testspänning och passera ström genom eventuella jonkanaler som finns i plåstret. "Problemet är att, i sitt normala tillstånd, vesiklar är för små för att nås via en patchpipett, så de måste förstoras innan några mätningar kan utföras, "säger Grimm. Men de farmakologiska verktygen som hittills har använts för detta ändamål verkar urskillningslöst på alla endolysosomala vesikeltyper. I ett försök att upptäcka mer specifika agenter, LMU -forskarna undersökte ett bibliotek av föreningar och identifierade en särskild kombination av två biologiska toxiner som selektivt inducerar förstoringen av tidiga endosomer genom att få dem att smälta med varandra. Dessutom, de kunde visa att en tredje molekyl selektivt förstorar sena endosomer och lysosomer. I synnerhet, inget av dessa ämnen verkar på återvinning av endosomer.

"Detta representerar ett betydande framsteg, eftersom vi nu har två uppsättningar verktyg som gör att vi kan använda mer specifika tillvägagångssätt och fråga vilka kanaler som är aktiva i vilka typer av vesiklar, "Förklarar Grimm. Faktum är att han och hans kollegor har använt de nya agenterna för att visa att den så kallade TRPML3-jonkanalen, som styr passagen av positivt laddade katjoner och pH (surhetsgrad) i vesiklar, är aktiv i både tidiga och sena endosomer och lysosomer. I kontrast, den relaterade TRPML1 -kanalen finns i sena endosomer och lysosomer, men inte i tidiga endosomer. Mutationer i TRPML -kanaler bidrar till patogenesen av allvarliga medfödda tillstånd som mukolipidoser, en sällsynt klass av metabola sjukdomar som försämrar nervsystemets funktion. "Tack vare vår förlängning av patch -fastspänning till intracellulära vesiklar, vi kan nu ta itu med dessa jonkanaler med större selektivitet. Detta är också viktigt i sökandet efter ämnen som specifikt kan hämma funktionerna hos särskilda jonkanaler för terapeutiska ändamål, "Påpekar Grimm.