Ett team av forskare ledda av Dr. Mike Sleutel från VIB-VUB Center for Structural Biology i samarbete med forskare från Institutet för komplexa molekylära system vid Eindhovens tekniska universitet, och CNRS i Grenoble, har för första gången avslöjat de molekylära detaljerna i proteinkristallkärnbildning, en process med stor medicinsk och vetenskaplig relevans. Teamet utvecklade också en ny metod för att studera en bred klass av system som hittills har varit svårfångade. Deras resultat publiceras i Natur .
Dr. Mike Sleutel (VIB-VUB):"Det kommer att bli spännande att se denna nya teknik tillämpas i framtiden för att följa proteinsjälvsammansättningsprocesser som är inblandade i en rad patologiska störningar, såsom vätske-vätskefasseparation vid bildning av grå starr i ögonen eller bildning av amyloidfibrer associerade med en rad neurologiska störningar."
Proteinkristaller har stor medicinsk och vetenskaplig relevans. I årtionden, de har varit avgörande för strukturbiologer att lösa de tredimensionella strukturerna hos proteiner, men proteinkristaller används också som biofarmaceutiska tillförselmedel. Kristallina suspensioner är attraktiva formuleringar för att lagra och administrera aktiva farmaceutiska föreningar på grund av deras långvariga hållbarhet, låg lösningsmedelsviskositet, och långsam upplösningshastighet. Det kanske mest kända exemplet är insulin:insulinsprutor omfattar subkutan injektion av en suspension av insulinmikrokristaller som löses långsamt för att ge en stadig och ihållande leverans över tiden. Trots deras enorma potential, det finns två faktorer som begränsar användningen av proteinkristaller i ett brett spektrum av tillämpningar.
Utmaningar i att utveckla proteinkristaller
Först, växande proteinkristaller, som många molekylärbiologer kommer att säga, är mer en konst än en vetenskap. Faktiskt, för många proteiner, kristallisation kan vara oerhört svårt. Detta beror delvis på det faktum att forskare inte förstår de tidiga stadierna av proteinkristallbildning. Vilken kristall som helst kommer från en kärna, ett litet kristallint frö, som bildas genom spontan gruppering av ett fåtal molekyler i lösning som måste anta en regelbunden organisation i tre dimensioner. Hur molekylerna inser denna osannolika bedrift har förblivit ett mysterium fram till denna punkt.
För det andra, ett enda protein kan kristallisera i flera olika kristallformer, detta är känt som polymorfism. Olika kristallpolymorfer har olika egenskaper, med de mest anmärkningsvärda kraften att diffraktera röntgenstrålar (viktigt för bestämning av 3D-struktur), och den hastighet med vilken den löser sig (avgörande för läkemedelsleverans). Hittills, det är mycket svårt att styra kristallisationsprocessen till den polymorf man vill. Forskare tror att polymorfselektion äger rum i kärnbildningsstadiet, men ingen vet exakt hur mekanismen fungerar.
Ett nytt sätt att se på självmontering av makromolekyler
Gruppen av forskare som leds av Dr. Mike Sleutel har använt den senaste kryotransmissionselektronmikroskopi (Cryo-TEM) för att fånga födelsen av en proteinkristall genom att visualisera kärnbildningsprocessen med molekylär upplösning.
Dr Heiner Friedrich förklarar:"Eftersom processen går så snabbt, och i en så liten skala behövde vi kryogeniskt stoppa provet i olika stadier av processen. När den har frusit i tiden, vi använder ett mycket känsligt elektronmikroskop för att visualisera proteinerna och hur de grupperar sig för att bilda en kärna och slutligen proteinkristallen."
Genom att analysera Cryo-TEM-bilder tagna från en serie prover med konstanta tidsintervall, de kan börja pussla ihop serierna av molekylära kollisioner som måste äga rum för att bilda en kristallin kärna. Dr. Mike Sleutel fortsätter:"Vi slogs av den oväntade komplexiteten i processen, vilket visade sig vara mycket mer invecklat än de arbetsmodeller vi och andra inom området hade innan dessa observationer. För proteinet som vi använde i vår studie avslöjade vi en hierarkisk självmonteringsprocess som involverar tre efterföljande stadier av självmontering i ständigt ökande längdskalor. "Dessa observationer är de första i sitt slag och ger ett nytt sätt att se på självmonterande processer av makromolekyler till större strukturer.
Men laget gick ännu ett steg längre, och jämförde kärnbildningsvägarna för multipla polymorfer. De visade att polymorfval dikteras av arkitekturen hos de minsta möjliga fragment som bildas vid tidiga tidpunkter. När sådana strukturer väl har bildats, tron på systemet är satt. Dr Alexander Van Driessche förklarar:"Genom att analysera och förstå skillnaderna i strukturen hos de olika kärnorna, Vi utvecklade strategier för att styra urvalsprocessen för polymorf. Vi uppnådde detta genom att försiktigt justera de olika sätten för interaktion som finns mellan molekylerna, styr kärnbildningsprocessen i riktning mot vårt val." Teamet tror att de nya insikterna och metoderna kommer att avsevärt främja utvecklingen av proteinkristaller för 3D-strukturbestämning och medicinska tillämpningar.
