Schemat över CFGpS-teknik med en pott. Glycoengineered E. coli som modifieras med (i) genomiska mutationer som gynnar glykosyleringsreaktioner och (ii) plasmid -DNA för att producera essentiella glykosyleringskomponenter (dvs. OST, LLO) fungerar som källstam för att producera råa S30 -extrakt. Kandidatglykosyleringskomponenter kan härledas från alla livets riken och inkluderar OST-enheter med en subenhet som C. jejuni PglB och LLO som bär N-glykaner från C. jejuni som monteras på Und-PP av Pgl-vägens enzymer. Efter extraktberedning genom lys av källstammen, biosyntes i en kruka av N-glykoproteiner initieras genom att extraktet grundas med DNA som kodar acceptorproteinet av intresse. Kreditera: Naturkommunikation (2018). DOI:10.1038/s41467-018-05110-x
Teknisk cellulär biologi, minus den faktiska cellen, är ett växande intresseområde för bioteknik och syntetisk biologi. Det är känt som cellfritt proteinsyntes, eller CFPS, och det har potential att tillhandahålla hållbara sätt att tillverka kemikalier, läkemedel och biomaterial.
Tyvärr, ett mångårigt gap i cellfria system är förmågan att tillverka glykosylerade proteiner-proteiner med kolhydratfäste. Glykosylering är avgörande för ett brett spektrum av viktiga biologiska processer, och förmågan att förstå och kontrollera denna mekanism är avgörande för behandling och förebyggande av sjukdomar.
Matthew DeLisa, William L. Lewis professor i teknik vid Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering vid Cornell University, och Michael Jewett, docent i kemisk och biologisk teknik vid Northwestern University, har gått ihop om ett nytt tillvägagångssätt som överbryggar denna klyfta. Deras system, den första i sitt slag, kapitaliserar på de senaste framstegen inom CFPS samtidigt som den viktiga glykosyleringskomponenten läggs till i en förenklad, "one-pot" -reaktion. Det valda proteinet kan sedan frystorkas och reaktiveras för syntes vid användning genom att helt enkelt tillsätta vatten.
DeLisa och Jewett är co-senior författare till "Single-pot Glycoprotein Biosynthesis Using a Cell-Free Transkription-Translation System Berikat med Glykosyleringsmaskiner, "publicerad 12 juli Naturkommunikation .
Thapakorn Jaroentomeechai, Ph.D. student i DeLisa Research Group, och Jessica Stark '12, Ph.D. student i Jewett -gruppen, är förste författare.
"Om du verkligen vill ha en användbar, bärbart och distribuerbart vaccin eller terapeutisk proteinteknik som är cellfri, du måste räkna ut kolhydratfästet, "Sa DeLisa." Det är, i huvudsak, vad vi har gjort på ett mycket kraftfullt sätt. "
Detta arbete kan påverka utvecklingen av decentraliserade tillverkningsstrategier. Snabb tillgång till proteinbaserade läkemedel i avlägsna miljöer kan förändra liv; nya biotillverkningsparadigm som är lämpliga för användning i miljöer med låga resurser kan främja bättre tillgång till kostsamma läkemedel genom lokala, produktion i små satser.
DeLisa har forskat mycket om de molekylära mekanismer som ligger till grund för proteinbiogenes i den komplexa miljön i en levande cell, Till exempel Escherichia coli ( E coli ). Medan hans labb har gjort några anmärkningsvärda genombrott, begränsningarna i detta område, han sa, är själva cellväggarna.
Jewetts lab på Northwestern har investerat mycket av sina forskningsinsatser i cellfri syntetisk biologi, som utnyttjar naturens mest eleganta biomaskiner utanför cellens gränser, så ett samarbete var en naturlig förlängning av båda laboratoriernas arbete.
"Inom bakteriell cellteknik, du är ständigt i en dragkamp, "Sa Jewett." Du introducerar en mekanism eller förmåga som är av intresse för dig som forskare, men vad cellen försöker göra för sig själv är att växa och överleva. "
För deras nya metod, laget framställde cellextrakt från en optimerad laboratoriestam av E. coli, CLM24, som selektivt berikades med viktiga glykosyleringskomponenter. De resulterande extrakten möjliggjorde ett förenklat reaktionsschema, som laget har kallat cellfritt glykoproteinsyntes (CFGpS).
"Ett stort framsteg i detta arbete är att våra cellfria extrakt innehåller alla molekylära maskiner för proteinsyntes och proteinglykosylering, "Stark sa." Det betyder att du bara behöver lägga till DNA -instruktioner för ditt protein av intresse för att göra ett glykoprotein i CFGpS. Detta är en drastisk förenkling från cellbaserade metoder och gör att vi kan göra sofistikerade glykoproteinmolekyler på mindre än en dag. "
Och CFGpS -metoden är mycket modulär, vilket möjliggör användning av distinkta och varierade extrakt som blandas för framställning av en mängd olika glykoproteiner.
"Eftersom vi valde E. coli, som saknar sin egen glykosyleringsmaskin, för att bygga vår CFGpS -plattform, det gav oss en tom skiffer för bottom-up-konstruktion av önskat glykosyleringssystem, "Jaroentomeechai sa." Detta ger oss den unika förmågan att kontrollera kolhydratstrukturer och renheter i glykoproteinerna på nivåer som för närvarande inte kan uppnås i andra cellbaserade expressionssystem. "
Även i utvecklade länder som USA, utvecklingen mot personlig medicin gör denna typ av on-demand läkemedelsproduktionsprotokoll attraktiv. "Du kan använda ett provrör istället för ett 50, 000-liters bioreaktor för att göra din produkt, som öppnar dörren till ett personligt biotillverkningsparadigm där varje patient kan få ett unikt proteinmedicin skräddarsytt för sin fysiologi, " han sa.
