Ny forskning belyser hur olika bakteriearter kan bygga komplexa nanoharpuner med olika proteinbyggstenar. Bakterier använder dessa harpuner som kallas typ VI-sekretionssystem för att injicera toxiner i närliggande celler. Forskare från University of Sheffield fann att även om proteinerna varierade, det fanns strukturellt liknande delar som samverkade med maskineriet.

Bakterier producerar komplexa nano-harpuner på sin cellyta. En av deras funktioner är att harpunera och injicera gifter i celler som finns i närheten. Att producera ett så komplext vapen kräver många olika rörliga komponenter som forskare fortfarande försöker förstå. Forskare från University of Sheffield har använt några av Diamonds kristallografiska strållinjer för att förstå en särskilt gåtfull bit av detta lilla pussel. Teamet ledd av David Rice och Mark Thomas arbetade på en proteinkomponent i harpunen som heter TssA som de redan visste var en integrerad del av maskineriet.

Dock, till skillnad från de andra komponenterna i harpunen, det finns distinkta varianter av TssA-proteinet som innehåller radikalt olika aminosyrasekvenser i ena änden av proteinet. Teamet visade att strukturerna för den variabla regionen av två olika TssA-subenheter var helt orelaterade och de kunde sättas samman till distinkt olika multisubunit-komplex vad gäller deras storlek och geometri. Detta väckte frågan om hur olika bakterier kunde använda detta protein med olika strukturer för att producera en harpun med samma funktion för alla arter. De fann att trots dessa skillnader, det fanns en mycket specifik konserverad region i den andra änden av proteinet. De antar att den konserverade regionen är den del som gör jobbet och hjälper harpunen att fungera medan den variabla regionen fungerar som en ställning. De använde I02, I03 och I24 i sin studie och planerar att göra uppföljningsarbete med hjälp av röntgenkristallografi och Cryo-EM som de vid eBIC-centret på Diamond. Forskningen publicerades i Naturkommunikation .

Bakteriella nano-harpuner och det gåtfulla TssA-proteinet

Biologisk krigföring i bakterier är relativt välkänd. En grupp bakterier vill annektera en knapp resurs för sig själva, så de producerar ett toxin som de är immuna mot och dödar alla potentiella inkräktare. Dock, vissa bakterier tar ett mer riktat tillvägagångssätt. Istället för att spy ut toxiner i den extracellulära miljön, de monterar miniatyrharpuner på sin yttersta yta och simmar runt och injicerar gifter direkt i potentiella angripare eller konkurrenter. Detta är inte en överdrift eller en metafor, just nu simmar bakterier runt och bokstavligen harpunerar varandra till döds. Dessa harpuner kallas typ VI-sekretionssystem (T6SS) och sedan de upptäcktes 2005 har forskare runt om i världen försökt förstå denna ingenjörskonst i miniatyr.

Sammansättningen och komplexiteten hos dessa molekylära maskiner utgör perfekta problem för strukturbiologin och många av proteinkomponenterna i dessa maskiner har undersökts med röntgenkristallografi eller kryo-elektronmikroskopi. Forskning har visat att hela systemet består av ett proteinkomplex som bildar en stor kammare som är förankrad i membranet. Detta håller ett vässat rör som skjuts ut så snart ett hölje runt det drar ihop sig mot en proteinbasplatta som ligger vid basen av kammaren, skjuta harpunen mot en intet ont anande granne.

Även om man vet mycket om T6SS, det finns fortfarande några kritiska komponenter som förblir gåtfulla, en av dessa är TssA-proteinet.

Många studier har visat att detta protein är en integrerad del av T6SS-maskineriet, men forskning om DNA som kodar för detta protein visar att det mellan arter, det finns mycket variation. Variation är normalt inte önskvärd i proteiner som har en väsentlig funktion, om du har ett recept som fungerar, det är inte en bra idé att plötsligt ändra en betydande del av det. Detta väckte några frågor, vad gör TssA-proteinet och vilken effekt har dessa variationer på funktionen?

Hur fungerar TssA-proteinet?

Forskargruppen började med att göra en analys av aminosyrasammansättningen i fyra olika TssA-proteiner. De fann att om de lade proteinsekvenserna i en rad, vänstersidan eller N-terminalen var alltid väldigt lika, och högersidan eller C-terminalen varierade mycket. Teamet undrade om dessa skillnader skulle stoppa TssA-proteinet från att interagera som förväntat med de andra proteinerna som behövs för att bygga bakterieharpunen. De utförde labbtester och fann att faktiskt, TssA-proteinet interagerade med nästan alla andra komponenter i harpunen exakt som förväntat. För att förstå varför, de gjorde flera resor till Diamond för att använda I02, I03 och I24 strållinjer för makromolekylär kristallografi. Genom att analysera data från de olika TssA-proteinerna fann man att de hade väldigt olika strukturer. Detta påverkade inte bara hur enstaka proteiner såg ut utan också hur de interagerade med varandra för att bilda multisubunit-komplex.

Forskarteamet visste redan om en publicerad struktur av proteinet som bildades till en 6-ledad ring när den monterades. Dock, deras nya studier visade att olika versioner av TssA-proteinet kunde bilda 5-ledade eller 16-ledade ringar. Trots skillnaderna, alla TssA-proteinerna hade en strukturellt konserverad del som alltid var belägen på utsidan av sammansättningskomplex. Detta fick forskargruppen att anta att det var denna bevarade sektion som var inblandad i funktionen hos bakterieharpunen. De resonerade att resten av proteinet som innehöll all variation fungerade som en ställning för att hålla proteinkomplexets arbetsenhet.

Vad har framtiden att erbjuda?

Även om bevisen är övertygande finns det fortfarande mer arbete att göra. Professor David Rice sa att "framtiden för detta arbete är att få fler exempel från olika bakteriearter och att kombinera kristallografidata med Cryo-EM-tekniker." I slutändan skulle teamet vilja undersöka strukturen och funktionen av hela T6SS-komplexet från olika bakterier för att kontrollera om deras hypotes är korrekt. De planerar att använda röntgenkristallografi vid strållinjer som I03, I24 samt den nybyggda VMXi. De planerar även att använda Cryo-EM som även finns på Diamonds eBIC-center. Kombinationen av dessa kompletterande strukturbiologiska tekniker kommer att tillåta forskarna att bygga upp en mer komplett bild av hur denna komplexa del av nanomaskineri är konstruerad och hur den fungerar.

Teknikerna som används kan också informera andra forskare med liknande frågor. Tidigare data hade föreslagit att TssA-proteinet var en homolog till ett basplateprotein som finns i bakteriofag. Denna studie visade att detta inte bara var fallet, men att TssA-proteinerna skilde sig mycket från varandra och hade till en början fått forskare att felaktigt tilldela funktionen. Detaljerat arbete med proteinsekvenserna, interaktionsstudier och noggranna strukturbiologiska experiment gjorde det möjligt för forskargruppen från Sheffield att avslöja en mer exakt bild av detta viktiga mikrobiella vapen.

Forskningen är också av stort intresse för kemister och ingenjörer som kan hämta inspiration från bakterierna för att tillverka egna nanomaskiner. Det finns potentiella tillämpningar inom infektionskontroll där harpunerna kan bli föremål för nya läkemedel för att inaktivera bakterier som använder dem när de orsakar infektioner. Det finns också tillämpningar inom läkemedelsleverans där harpunerna kan användas för att injicera peptid- och proteinläkemedel i specifika målceller. På en mer grundläggande nivå, att bara förstå hur en så liten och komplex rörlig maskin kan konstrueras och hur den fungerar kan en dag hjälpa oss att bygga vår egen.