Olika bildbaserade centrala positionsuppskattningsmetoder (benämnda "centroidpassning") metoder såsom 2-D Gaussianpassningsmetoder har vanligen använts i enmolekylär lokaliseringsmikroskopi (SMLM) för att exakt bestämma platsen för varje fluorofor. Ändå är det fortfarande en utmaning att förbättra enkelmolekylens laterala lokaliseringsprecision till molekylär skala ( <2 nm) för hög genomströmning nanostruktur avbildning.

I en studie publicerad online i Naturmetoder , Prof. Xu Tao och prof. Ji Wei från Institute of Biophysics of the Chinese Academy of Sciences utvecklade en ny interferometrisk enmolekylerad lokaliseringsmikroskopiprocess med snabb modulerad strukturerad belysning, kallas Repetitive Optical Selective Exposure (ROSE).

ROSE använder sex olika riktningar och fasinterferensfransar för att excitera de fluorescerande molekylerna. Intensiteten hos de fluorescerande molekylerna är nära besläktad med fasen av interferensfransarna. En fluorescensmolekyl är lokaliserad av intensiteten hos flera excitationsmönster i en interferensfrans, ger ungefär tvåfaldig förbättring av lokaliseringsprecisionen. Denna teknik har drivit upplösningen av enmolekylär lokaliseringsmikroskopi (SMLM) till mindre än 3 nm (~ 1 nm lokaliseringsprecision).

Forskarna designade först tre olika gallergaller av DNA origami-strukturer med 5-, 10- och 20-nm punkt-till-punkt-avstånd för att verifiera prestanda för ROSE. Både konventionell centroidmontering och ROSE kan lösa 20-nm-strukturen vid samma fotonbudget. ROSE kan också tydligt lösa 10-nm-avståndet, som inte kunde lösas med centroidmontering.

Forskarna visade att ROSE kunde lösa en 5-nm-struktur med en upplösning på ~ 3 nm över ett stort synfält på 25 x 25 μm ² , vilket innebär att ROSE har förmågan att driva upplösningsförmågan hos SMLM till molekylskala.

Dessutom, använder ROSE för att analysera cellulära nanostrukturer, forskarna visade att ROSE har fördelar med att lösa den ihåliga strukturen hos enstaka mikrotubuli -filament, små klatrinbelagda gropar (CCP) och cellulära nanostrukturer av aktinfilament. Fourier -ringkorrelationsanalysen (FRC) indikerade att ROSE förbättrade den slutliga upplösningen med två gånger jämfört med centroid -anpassningsmetoden.

ROSE kan utökas till 3-D nanometer-skala avbildning genom att införa ytterligare excitationsmönster längs axiell riktning. Forskarna föreställer sig att denna metod kan förlänga tillämpningen av SMLM i biomakromolekylär dynamisk analys och strukturstudier på molekylär skala.