1. Nick Translation:
* Reaktion: Denna metod använder enzymet DNA -polymeras I För att ersätta nukleotider i en DNA -sträng med märkta nukleotider. Det fungerar genom att introducera enkelsträngade pauser (nicks) i DNA med dNase I . Polymeraset använder sedan nicket som en primer och innehåller märkta nukleotider i gapet.
* isotoper: Vanligtvis används isotoper är ³²P-DCTP eller ³²P-DATP .
* Fördelar: Producerar hög specifik aktivitet (etikettdensitet) och är lämplig för både enkel- och dubbelsträngat DNA.
* Nackdelar: Kräver ett specifikt enzym och kan vara känsligt för buffertförhållandena.
2. Slumpmässig primermärkning:
* Reaktion: Denna metod använder korta slumpmässiga oligonukleotidprimrar och DNA -polymeras I (Klenow -fragment) för att syntetisera en ny DNA -sträng som komplementär till mallsträngen. Polymeraset innehåller märkta nukleotider under syntesen.
* isotoper: Vanligtvis används isotoper är ³²P-DCTP eller ³²P-DATP .
* Fördelar: Effektivt och kan användas för att märka både enkel- och dubbelsträngat DNA.
* Nackdelar: Kan införa en del bakgrundsmärkning på grund av den slumpmässiga primerbindningen.
3. Slutmärkning med kinaser:
* Reaktion: Denna metod använder polynukleotidkinas För att lägga till en fosfatgrupp vid 5' -änden av ett DNA -fragment. Fosfatgruppen är märkt med en radioaktiv isotop.
* isotoper: Vanligtvis ³²P-ATP eller ³³p-ATP används.
* Fördelar: Enkelt och enkelt, särskilt användbart för att märka korta DNA -fragment.
* Nackdelar: Endast märker 5' -slutet av DNA.
4. PCR -märkning:
* Reaktion: Denna metod innebär att använda radioaktiva DNTP:er (som ³²P-DCTP ) under PCR -reaktionen. Detta innehåller etiketten i de nyligen syntetiserade DNA -strängarna.
* isotoper: Vanligtvis används isotoper är ³²P-DCTP eller ³²P-DATP .
* Fördelar: Effektivt och kan användas för att märka specifika DNA -sekvenser.
* Nackdelar: Kan vara mindre effektiv än andra metoder och kan vara svåra att få hög specifik aktivitet.
5. In vitro -transkription:
* Reaktion: Använder RNA -polymeras För att transkribera en DNA -mall till RNA. RNA är märkt med radioaktiva nukleotider under syntesen.
* isotoper: Vanligtvis ³²P-UTP eller ³⁵s-UTP .
* Fördelar: Kan producera mycket märkta RNA -prober för hybridiseringsstudier.
* Nackdelar: Kräver specialiserade reagens och förhållanden för in vitro -transkription.
Valet av märkningsmetod beror på den specifika applikationen och de önskade egenskaperna för det märkta DNA.
Obs: Användningen av radioaktiva isotoper har minskat under de senaste åren på grund av säkerhetsproblem och tillgängligheten av icke-radioaktiva märkningsmetoder. Radioaktiv märkning har emellertid fortfarande vissa fördelar i vissa applikationer, särskilt för känslighet och förmågan att upptäcka mål med lågt överflöd.
