Konventionella mikroskop ger viktig information om prover i två dimensioner - mikroskopglasets plan. Men platt är inte allt det. I många fall, information om objektet i den tredje dimensionen - axeln vinkelrätt mot mikroskopglaset - är lika viktig att mäta.

Till exempel, för att förstå funktionen hos ett biologiskt prov, om det är en DNA -sträng, vävnad, organ eller mikroskopisk organism, forskare skulle vilja ha så mycket information som möjligt om objektets tredimensionella struktur och rörelse. Tvådimensionella mätningar ger en ofullständig och ibland otillfredsställande förståelse av provet.

Nu har forskare vid National Institute of Standards and Technology (NIST) hittat ett sätt att konvertera ett problem som påverkar nästan alla optiska mikroskop - linsavvikelser, som orsakar ofullkomlig fokusering av ljus - till en lösning som gör det möjligt för konventionella mikroskop att exakt mäta positionerna för ljuspunkter på ett prov i alla tre dimensioner.

Även om andra metoder har gjort det möjligt för mikroskop att tillhandahålla detaljerad information om tredimensionell struktur, dessa strategier har tenderat att vara dyra eller kräva specialkunskaper. I ett tidigare tillvägagångssätt för att mäta positioner i den tredje dimensionen, forskare ändrade optiken för mikroskop, till exempel genom att lägga till extra astigmatism i linserna. Sådana förändringar krävde ofta ombyggnad och omkalibrering av det optiska mikroskopet efter att det lämnat fabriken.

Den nya mätmetoden gör det också möjligt för mikroskop att lokalisera objektens positioner mer exakt och exakt. Optiska mikroskop löser vanligtvis objekternas positioner till ett område som inte är mindre än några hundra nanometer (miljardelar av en meter), en gräns som sätts av ljusets våglängd som gör bilden och mikroskoplinsernas upplösningseffekt. Med den nya tekniken, konventionella mikroskop kan identifiera positionerna för enskilda ljusemitterande partiklar inom en region som en hundradel som liten.

NIST -forskarna Samuel Stavis, Craig Copeland och deras kollegor beskrev deras arbete i 24 juni -numret av Naturkommunikation .

Metoden bygger på en noggrann analys av bilder av fluorescerande partiklar som forskarna deponerade på platta kiselskivor för kalibrering av deras mikroskop. På grund av linsavvikelser, när mikroskopet rörde sig upp och ner med specifika steg längs den vertikala axeln - den tredje dimensionen - verkade bilderna snedställda och partiklarnas former och positioner tycktes förändras. NIST -forskarna fann att avvikelserna kan ge stora snedvridningar i bilder även om mikroskopet rör sig bara några mikrometer (miljondelar av en meter) i sidoplanet eller några tiotals nanometer i den vertikala dimensionen.

Analysen gjorde det möjligt för forskarna att modellera exakt hur linsavvikelser förändrade utseende och skenbar plats för fluorescerande partiklar med förändringar i vertikal position. Genom att noggrant kalibrera det förändrade utseendet och skenbara platsen för en partikel till dess vertikala läge, laget lyckades använda mikroskopet för att exakt mäta positioner i alla tre dimensioner.

"Kontraintuitivt, linsavvikelser begränsar noggrannheten i två dimensioner och möjliggör noggrannhet i tre dimensioner, "sa Stavis." På detta sätt, vår studie ändrar perspektivet på dimensionen hos optiska mikroskopbilder, och avslöjar potentialen hos vanliga mikroskop för att göra extraordinära mätningar. "

Genom att använda den latenta informationen från linsavvikelser kompletterar de mindre tillgängliga metoder som mikroskopister för närvarande använder för att göra mätningar i den tredje dimensionen, Noterade Stavis. Den nya metoden har potential att bredda tillgängligheten för sådana mätningar.

Forskarna testade sin kalibreringsmetod med hjälp av mikroskopet för att avbilda en konstellation av fluorescerande partiklar som slumpmässigt deponerades på ett mikroskopiskt kiselutrustning som roterade i alla tre dimensioner. Forskarna visade att deras modell korrekt korrigerade för linsavvikelser, möjliggör mikroskopet att tillhandahålla fullständig tredimensionell information om partiklarnas position.

Forskarna kunde sedan förlänga sina positionsmätningar för att fånga hela rörelsens räckvidd, inklusive dess rotation, vingla och gunga, slutföra utvinning av rumslig information från systemet. Dessa nya mätningar belyste konsekvenserna av nanoskala mellanrum mellan mikrosystemdelar, som varierade på grund av brister i systemets tillverkning. Precis som ett löst lager på ett hjul får det att vingla, studien visade att luckorna i nanoskala mellan delar inte bara försämrade precisionen i avsiktlig rotation, men orsakade också oavsiktlig vingling, gunga och till och med böja växeln, som alla kan begränsa dess prestanda och tillförlitlighet.

Mikroskopilaboratorier kan enkelt implementera den nya metoden, Sa Copeland. "Användaren behöver bara ett standardprov för att mäta deras effekter och en kalibrering för att använda de resulterande data, "tillsatte Stavis. Bortsett från de fluorescerande partiklarna eller en liknande standard, som redan finns eller håller på att växa fram, ingen extra utrustning behövs. Den nya tidskriftsartikeln innehåller demonstrationsprogramvara som vägleder forskare i hur man använder kalibreringen.