Diagram över den föreslagna metoden för att extrahera intakta lysosomer. När magnetiska nanopartiklar har samlats naturligt i en cells lysosomer genom den endocytiska vägen, spricker cellmembranet. och dess innehåll "siktades" i 30 minuter med hjälp av magneter. I slutet av denna process kan intakta lysosomer hämtas från magneterna och användas för att studera deras struktur, metaboliter och proteinsammansättning. Kredit:Shinya Maenosono
Cellernas korrekta funktion vilar på den exakta orkestreringen av många komplexa processer och organeller. Lysosomer - vitala cellorganeller - är enzymfyllda subenheter som finns i många djurceller som hjälper till att bryta ner och återanvända makromolekyler, såsom proteiner, lipider och nukleotider. Förutom sin funktion i cellulär matsmältning och avfallshantering deltar lysosomer också i aminosyrasignalering, vilket stimulerar proteinsyntesen vid sidan av andra effekter.
Med tanke på att många sjukdomar orsakas av defekter i lysosomfunktionen är det ingen överraskning att forskare aktivt har försökt förstå dessa organeller i årtionden. Men det finns bara ett fåtal tekniker som tillåter extraktion av lysosomer inifrån en cell. Den vanligaste metoden kallas "densitetsgradient ultracentrifugering". Det innebär att försiktigt bryta cellmembranet och applicera en centrifugalkraft på cellens innehåll. Detta separerar cellkomponenterna genom densitet. Tyvärr har vissa andra organeller samma densitet som lysosomer, vilket resulterar i prover med föroreningar. Dessutom tar processen så lång tid att många lysosomala proteiner redan har gått förlorade och/eller nedbrutna när den är klar.
En mer avancerad teknik, kallad "immunutfällning", bygger på att modifiera lysosomers ytproteiner så att de kan fångas upp av magnetiska pärlor täckta av speciellt skräddarsydda antikroppar. Även om detta tillvägagångssätt ger renare resultat, modifieras proteinsammansättningen av de extraherade lysosomerna genom proceduren och följaktligen kan efterföljande proteinanalyser äventyras. Det är alltså uppenbart att vi måste hitta ett bättre sätt att extrahera lysosomer från celler.
Lyckligtvis har ett team av vetenskapsmän under ledning av Prof. Shinya Maenosono från Japan Advanced Institute of Science and Technology (JAIST) tagit steget upp och utvecklat en ny strategi för att snabbt separera intakta lysosomer med hög renhet. Denna studie publicerades i ACS Nano och inkluderade även prof. Kazuaki Matsumura och docent Yuichi Hiratsuka från JAIST, och prof. Tomohiko Taguchi från Tohoku University, Japan.
Deras strategi är centrerad kring användningen av magnetiska-plasmoniska hybridnanopartiklar (MPNP) gjorda av silver och en järn-koboltlegering och täckta av en förening som kallas aminodextran (aDxt). Grunden för detta tillvägagångssätt är att de aDxt-täckta MPNP:erna naturligt intas av cellerna genom "endocytos", som kulminerar inuti lysosomer. När tillräckligt många MPNP har samlats inuti lysosomerna kan cellerna försiktigt "krossas" och lysosomerna hämtas med magneter.
För att den här metoden ska fungera är det viktigt att MPNP endast finns i lysosomer och inte i andra organeller. Det är här plasmonavbildning kommer väl till pass, eftersom det distinkta sättet plasmoniska nanopartiklar interagerar med ljus gör dem lätta att visualisera med ett optiskt mikroskop. Genom att färga varje typ av organell i den endocytiska vägen annorlunda med hjälp av immunfärgning och kontrollera hur platsen för MPNPs överlappar dem, bestämde forskarna den exakta tiden det tar mest MPNP att nå lysosomerna. Detta säkerställer i sin tur att separationsprocessen ger lysosomprover med hög renhet.
Efteråt analyserade teamet effekterna av temperatur och magnetisk separationstid på proteinsammansättningen av de extraherade lysosomerna. Deras resultat visade att proteinförlusten var anmärkningsvärt snabb, även vid temperaturer så låga som 4°C. Lyckligtvis var deras tillvägagångssätt tillräckligt snabbt för att extrahera intakta lysosomer, som Prof. Maenosono framhåller:"Vi fann att den maximala tiden som krävs för att isolera lysosomer efter cellruptur var 30 minuter, vilket är betydligt kortare än den tid som krävs med centrifugeringsbaserade tekniker, som vanligtvis kräver en minsta separationstid på flera timmar."
Sammantaget kommer denna nya teknik att hjälpa forskare att utforska lysosomers ömtåliga metaboliter och hur de förändras som svar på stimuli. Detta ska i sin tur bana väg för nya insikter om störningar relaterade till lysosomal dysfunktion. I detta avseende kommenterar Prof. Maenosono:"Med tanke på lysosomes djupgående relation med många cellulära metaboliter, är en djupare förståelse av lysosomal funktion nödvändig för att bestämma dess reglering i olika celltillstånd. Därför kan vår teknik bidra till bättre förståelse och behandling av lysosomala sjukdomar i framtiden." Dessutom kan detta nya tillvägagångssätt modifieras för att extrahera andra organeller förutom lysosomer. Förhoppningsvis kommer denna studie att föra oss närmare att förstå innehållet i celler i mycket högre grad. + Utforska vidare
