Forskare från Broad Institute och MIT som först använde CRISPR för redigering av däggdjursgenom har konstruerat ett nytt molekylärt system för att effektivt redigera RNA i mänskliga celler. RNA redigering, som kan förändra genprodukter utan att göra förändringar i genomet, har stor potential som verktyg för både forskning och sjukdomsbehandling.

I en tidning som publicerades idag i Vetenskap , seniorförfattaren Feng Zhang och hans team beskriver det nya CRISPR-baserade systemet, kallas RNA-redigering för programmerbar A till I-ersättning, eller "REPARATION". Systemet kan ändra enstaka RNA-nukleosider i däggdjursceller på ett programmerbart och exakt sätt. REPAIR har förmågan att vända sjukdomsframkallande mutationer på RNA-nivå, såväl som andra potentiella terapeutiska och grundläggande vetenskapliga tillämpningar.

"Förmågan att korrigera sjukdomsorsakande mutationer är ett av de primära målen för genomredigering, sa Zhang, en kärninstitutsmedlem vid Broad Institute och utredare vid McGovern Institute for Brain Research vid MIT. "Än så länge, vi har blivit väldigt bra på att inaktivera gener, men att faktiskt återställa förlorad proteinfunktion är mycket mer utmanande. Denna nya förmåga att redigera RNA öppnar upp fler potentiella möjligheter att återställa den funktionen och behandla många sjukdomar, i nästan vilken cell som helst."

REPAIR har förmågan att rikta in sig på individuella RNA-bokstäver, eller nukleosider, byta adenosiner till inosiner (läses som guanosiner av cellen). Dessa bokstäver är involverade i singelbasförändringar som är kända för att regelbundet orsaka sjukdomar hos människor. Vid mänskliga sjukdomar, en mutation från G till A är extremt vanlig; dessa förändringar har varit inblandade i, till exempel, fall av fokal epilepsi, Duchennes muskeldystrofi, och Parkinsons sjukdom. REPAIR har förmågan att vända effekten av alla patogena G-till-A-mutationer oavsett dess omgivande nukleotidsekvens, med potential att fungera i vilken celltyp som helst.

Till skillnad från de permanenta förändringarna av genomet som krävs för DNA-redigering, RNA-redigering erbjuder en säkrare, mer flexibelt sätt att göra korrigeringar i cellen. "REPAIR kan fixa mutationer utan att manipulera genomet, och eftersom RNA naturligt bryts ned, det är en potentiellt reversibel fix, " förklarade den första författaren David Cox, en doktorand i Zhangs labb.

För att skapa REPAIR, forskarna profilerade systematiskt CRISPR-Cas13-enzymfamiljen för potentiella "redaktörskandidater" (till skillnad från Cas9, Cas13-proteinerna riktar in sig på och skär RNA). De valde ett enzym från Prevotella-bakterier, kallas PspCas13b, vilket var det mest effektiva för att inaktivera RNA. Teamet konstruerade en inaktiverad variant av PspCas13b som fortfarande binder till specifika RNA-sträckor men saknar sin "saxliknande" aktivitet, och smält det till ett protein som heter ADAR2, som ändrar nukleosiden adenosin till inosin i RNA-transkript.

I REPARATION, det deaktiverade Cas13b-enzymet söker efter en målsekvens av RNA, och ADAR2-elementet utför nukleosidomvandlingen utan att klippa transkriptet eller förlita sig på något av cellens ursprungliga maskineri.

Teamet modifierade ytterligare redigeringssystemet för att förbättra dess specificitet, minska detekterbara redigeringar utanför målet från 18, 385 till endast 20 i hela transkriptomet. Den uppgraderade inkarnationen, REPAIRv2, uppnådde konsekvent den önskade redigeringen i 20 till 40 procent – ​​och upp till 51 procent – ​​av ett riktat RNA utan tecken på betydande aktivitet utanför målet. "Framgången vi hade att konstruera detta system är uppmuntrande, och det finns tydliga tecken på att REPAIRv2 kan utvecklas ytterligare för mer robust aktivitet samtidigt som specificiteten bibehålls, " sa Omar Abudayyeh, co-första författare och en doktorand i Zhangs labb.

För att visa REPAIRs terapeutiska potential, teamet syntetiserade de patogena mutationerna som orsakar Fanconi-anemi och X-länkad nefrogen diabetes insipidus, introducerade dem i mänskliga celler, och framgångsrikt korrigerat dessa mutationer på RNA-nivå. För att driva de terapeutiska utsikterna ytterligare, teamet planerar att förbättra REPAIRv2:s effektivitet och paketera den i ett leveranssystem som är lämpligt för att introducera REPAIRv2 i specifika vävnader i djurmodeller.

Forskarna arbetar också med ytterligare verktyg för andra typer av nukleosidanvandlingar. "Det finns en enorm naturlig mångfald i dessa enzymer, " sa medförfattaren Jonathan Gootenberg, en doktorand i både Zhangs labb och labbet för medlemmen av Broad core institutet Aviv Regev. "Vi letar alltid efter att utnyttja naturens kraft för att genomföra dessa förändringar."

Zhang, tillsammans med Broad Institute och MIT, planerar att dela REPAIR-systemet brett. Som med tidigare CRISPR-verktyg, grupperna kommer att göra denna teknik fritt tillgänglig för akademisk forskning via Zhang-labbets sida på plasmiddelningswebbplatsen Addgene, genom vilken Zhang-labbet redan har delat reagens mer än 42, 000 gånger med forskare vid mer än 2, 200 labb i 61 länder, påskynda forskningen runt om i världen.