Jeff Chao, Juniorgruppledare på FMI, och hans grupp utvecklade en sofistikerad metod för att mäta mRNA-nedbrytning i enstaka celler. De utvecklade en fluorescerande biosensor som tillåter särskiljning av intakta transkript och nedbrytningsintermediärer. Denna nya metod, känd som BEHANDLA, kompletterar på ett bra sätt den metod de utvecklade tidigare, kallas TRICK, som mäter proteinöversättning.

Ett RNAs liv börjar i kärnan, där det syntetiseras och ytterligare modifieras – capped, skarvad och polyadenylerad. Det rör sig sedan in i cytoplasman där det översätts till ett protein, och så småningom degraderas. Mängden protein som produceras beror till stor del på regleringen av transkription, men också överflöd av mRNA. Som FMI-gruppledare, Jeff Chao påpekar, "Det har blivit allt tydligare att regleringen av mRNA-nedbrytning, särskilt under utveckling eller snabba miljöförändringar, kan dramatiskt påverka RNA-nivåer." Medan många av RNA-nedbrytningsstegen har karakteriserats, en tydlig förståelse för när och var försämring sker har saknats hittills.

Jeff Chao och hans team har nu utvecklat en fluorescerande mikroskopimetod som gör att de kan mäta den rumsliga och tidsmässiga dynamiken i nedbrytningen av enstaka mRNA-molekyler i levande celler.

Chao och hans kollegor drog fördel av en viral RNA-struktur som bildar en knutliknande struktur. Denna pseudo-knut förhindrar nedbrytningen av mRNA av Xrn1, ett 5'-3' exoribonukleas. Chao förklarar:"Med hjälp av en mångfärgad biosensor som innehåller dessa virala pseudo-knutar, vi kunde skilja mellan intakta mRNA-transkript och mRNA-transkript som bryts ned." Forskarna kallade denna teknik för TREAT for 3(Three)'-RNA End Accumulation under Turnover.

Först och viktigast, TREAT gjorde det möjligt för forskaren att observera mRNA-nedbrytning i realtid i levande celler. För att visualisera försämring, forskarna konstruerade ett transkript som är märkt med två RNA-bindande proteiner sammansmälta med två distinkta fluorescerande taggar:ett av proteinerna – PP7 (märkt med grönt fluorescerande protein) – binder till den kodande regionen av mRNA, medan den andra – MS2 (med en röd tagg) – binder till den otranslaterade 3'-regionen. Mellan PP7 och MS2, forskarna introducerade de virala pseudo-knuten. Sålunda märkt, de individuella otranslaterade mRNA:n verkar gula. När RNA bryts ned av XRN1, den grönmärkta PP7 är förskjuten. Dock, vid positionen för pseudo-knuten, XRN1-nedbrytning stannar, som tillåter detektering av en kvantifierbar färgförändring från gult till rött.

Dessutom, Chao kommenterar:"Genom att använda TREAT, vi har kunnat mäta mRNA-sönderfall i enstaka celler och funnit att individuella nedbrytningshändelser inträffar oberoende i cytosolen. De nedbrutna mRNA:n ackumulerades inte i bearbetningskroppar." Dessa är viktiga första insikter eftersom bearbetningskropparna ansågs spela en direkt roll i RNA-nedbrytning. Bearbetande kroppar är membranlösa fack som bildas under fasövergångar. De består av RNA- bindande proteiner och mRNA, och eftersom de innehåller många proteiner involverade i mRNA-omsättning, det föreslogs att de är cellulära ställen för RNA-nedbrytning.

"TREAT kompletterar fint den andra tekniken som vi utvecklade tidigare kallad TRICK. Med valet av lämpliga fluorescerande markörer, vi kan nu övervaka både RNA-omsättning och RNA-översättning "live", och vi kan ta upp hur dessa processer är sammankopplade inom en enda cell, säger Chao.