Figur 1. Cas9 -strukturer. Från vänster till höger:Cas9 ensam (apo-Cas9), Cas9 bunden till RNA (Cas9 – RNA), Cas9–RNA bundet till dess enkelsträngade DNA-mål (Cas9–RNA–DNA), Cas9 – RNA bunden till en partiell DNA-duplex (Cas9 – RNA – DNA) och Cas9 – RNA bunden till sitt dubbelsträngade DNA-mål (Cas9 – RNA – DNA). Upphovsman:Kanazawa University
Forskare vid Kanazawa University och University of Tokyo rapporterar i Naturkommunikation visualisering av dynamiken i "molekylsax"-huvudmekanismen för genteknikstekniken CRISPR-Cas9.
En av de tekniker som används inom genteknik-processen för att artificiellt modifiera genomet för en levande organism-involverar det så kallade CRISPR-Cas9-nukleassystemet. Genom att använda detta system, en cells DNA kan skäras på en önskad plats, där gener kan raderas eller läggas till. Valet av platsen som ska skäras görs med en "guide RNA" -molekyl bunden till Cas9 -proteinet. Nu, ett team av forskare under ledning av Mikihiro Shibata från Kanazawa University och Osamu Nureki från University of Tokyo har visualiserat dynamiken i CRISPR-Cas9-komplexet, särskilt hur det skär DNA, ger värdefulla insikter i den CRISPR-Cas9-medierade DNA-klyvningsmekanismen.
För deras visualiseringsstudier, forskarna använde höghastighets atomkraftsmikroskopi (HS-AFM), en metod för avbildning av ytor. En yta sonderas genom att flytta en liten cantilever över den; den kraft som sonden upplever kan omvandlas till ett höjdmått. En skanning av hela ytan resulterar sedan i en höjdkarta över provet. Den snabba experimentella installationen av Shibata och kollegor möjliggjorde extremt snabb, upprepade skanningar - konverterbara till filmer - av biomolekylerna som deltar i den molekylära saxverkan.
Först, forskarna jämförde Cas9 utan och med RNA bifogat (Cas9 – RNA). De fann att den förra flexibelt kunde anta olika konformationer, medan den senare har en fast, struktur med två flikar, belyser konformationsstabiliseringsförmågan hos guide-RNA. Sedan, Shibata och kollegor tittade på hur det stabiliserade Cas9 -RNA -komplexet riktar sig mot DNA. De bekräftade att det binder till en förvald protospacer intilliggande motiv (PAM) plats i DNA. En PAM är en kort nukleotidsekvens som ligger bredvid DNA:s målställe, som är komplementär till guide-RNA:t.
Forskargruppens höghastighetsfilmer avslöjade vidare att målinriktning ('DNA-förhör') uppnås genom 3-D-diffusion av Cas9-RNA-komplexet. Till sist, forskarna lyckades visualisera dynamiken i själva klyvningsprocessen:de observerade hur regionen "molekylsax" genomgår konformationsfluktuationer efter att Cas9 – RNA lokalt rullar upp det dubbelsträngade DNA (film 1 [URL]).
Figur 2. HS-AFM-filmer av DNA-klyvning med Cas9 – RNA. Fluktuationer i nukleasdomänen indikeras med magentafärgade pilar. Klyvningsprodukterna som släpps från Cas9 – RNA indikeras med blå pilar. Upphovsman:Kanazawa University
Shibatas arbete främjar vår förståelse av CRISPR-Cas9-genomredigeringsmekanismen. Med forskarnas ord:"... denna studie ger oöverträffade detaljer om den funktionella dynamiken i CRISPR-Cas9, och lyfter fram potentialen hos HS-AFM för att belysa verkningsmekanismerna för RNA-styrda effektor-nukleaser från distinkta CRISPR-Cas-system. "
CRISPR-Cas9
CRISPR, förkortning för "klustrade, korta palindromiska upprepningar med regelbundet mellanrum", avser en uppsättning bakteriella DNA -sekvenser som innehåller fragment av DNA från virus som tidigare angripit bakterierna. Dessa fragment används av bakterierna för att förhindra ytterligare attacker av samma virus. "Cas" avser CRISPR-associerade gener; "Cas9" är ett CRISPR-associerat protein med två nukleasdomäner (ett nukleas är ett enzym som kan klyva nukleinsyror, organiska molekyler som finns i DNA och RNA).
På senare år har en genteknik där ett CRISPR-Cas9-komplex fungerar som en "molekylär sax" har utvecklats; Cas9 -nukleaset binder till en guide -RNA -molekyl som innehåller information om DNA -platsen att rikta in sig på. Med hjälp av höghastighets atomkraftmikroskopi, Mikihiro Shibata från Kanazawa University och kollegor har nu studerat dynamiken i CRISPR-Cas9-komplexet i detalj.
Atomkraftsmikroskopi
Atomic force microscopy (AFM) is an imaging technique in which the image is formed by scanning a surface with a very small tip. Horizontal scanning motion of the tip is controlled via piezoelectric elements, while vertical motion is converted into a height profile, resulting in a height distribution of the sample's surface. As the technique does not involve lenses, its resolution is not restricted by the so-called diffraction limit. In a high-speed setup, AFM can be used to produce movies of a sample's evolution in real time. High-speed AFM has been used successfully to study protein dynamics, for example myosin V walking on an actin filament, the photo-induced conformational change of bacteriorhodopsin, and the degradation of cellulose. Shibata and colleagues have now applied the high-speed AFM technique for visualizing the dynamics of DNA cleavage by CRISPR-Cas9.
