I mer än ett halvt sekel har studier på den afrikanska klövgrodan (Xenopus laevis) har hjälpt forskare att bättre förstå livets biologiska grund, från embryonal utveckling och neurobiologi till genetik och sjukdom. Grodans påståenden om berömmelse inkluderar den nobelprisvinnande upptäckten att vuxna cellöden kan omprogrammeras, och det fungerade en gång som världens enda pålitliga graviditetstest.

Nu, ny teknik gör det möjligt för forskare att lära sig ännu mer om de grundläggande processer som driver biologin från dessa hemtrevliga modellorganismer.

Rapportering i Förfaranden från National Academy of Sciences , ett team som leds av Harvard Medical Schools systembiolog Marc Kirschner beskriver en ny metod för att identifiera och mäta förändringar i tusentals proteiner när Xenopus -ägg genomgår befruktning.

Deras forskning avslöjar tidigare ogenomskinliga aspekter av de molekylära mekanismerna som är involverade i befruktning, inklusive detaljer om hur befruktning utlöser förstörelse av ett litet antal proteiner med lågt antal för att frigöra "bromsarna" på ett äggs cellcykel, och hur ägget snabbt frigör stora mängder protein för att förhindra befruktning av flera spermier.

Resultaten möjliggör omfattande analyser av proteindynamik i en cell inom ett snävt tidsfönster, sa forskarna, som kan informera studier om molekylärt beteende i ett brett spektrum av biologiska system och hjälpa till att belysa cellulära förändringar som driver sjukdom.

"Vi har utvecklat en metod som ger oss en kritiskt viktig förmåga att kvantifiera och mäta absoluta proteinnivåer och proteinmodifieringar i en dynamisk, komplext system, sa Kirschner, John Franklin Enders University professor i systembiologi och ordförande för institutionen för systembiologi vid Harvard Medical School.

"Metoden bör användas i stor utsträckning i många biologiska och biomedicinska studier, "Tillade Kirschner.

Xenopusägg har använts i decennier för att undersöka de molekylära händelserna som uppstår under befruktning, belyser cellcykeln, celldelning och embryonal utveckling.

Även om mycket är känt från år av studier, forskare har fortfarande en ofullständig förståelse för många aspekter av befruktning på grund av tekniska begränsningar - i synnerhet en omfattande bild av proteinerna som är inblandade, deras funktioner och vad som händer med dem över tid.

Streckkodsskanning

Med kollegorna Marc Presler och Elizabeth Van Itallie, doktorander i systembiologi vid Harvard Medical School, och Allon Klein och Steven Gygi, professorer i systembiologi och cellbiologi vid Harvard Medical School, Kirschner och forskargruppen använde en teknik för att märka proteiner i Xenopus-ägg med streckkodsliknande kemiska taggar, tillåter forskarna att analysera tusentals proteiner samtidigt med masspektrometri.

I kombination med en ny analytisk metodik, detta tillvägagångssätt gjorde det möjligt för laget att mäta de absoluta nivåerna av proteiner i en cell och avslöja detaljer om ett proteins fosforylering - en av de primära kemiska modifieringarna som celler använder för att reglera proteinets aktivitet.

Tar mätningar under och upp till 20 minuter efter befruktning, forskarna fann att halterna av ett litet antal lågproteinproteiner snabbt sjunker.

Inom några minuter, förstörelsen av dessa proteiner orsakar omvända fosforylering av ett mycket bredare proteinområde genom hela cellen - en process som främjar slutförandet av cellcykeln, inklusive separation av kromosomkopior, som förbereder ägget för ytterligare tillväxt.

Medan endast cirka 0,01 procent av cellens totala proteinmassa nedbröts, laget fann att befruktning också utlöser utvisning av 50 gånger denna mängd protein från cellen. Lagras främst i cellfack nära membranet, dessa uppsättningar proteiner utsöndras sannolikt för att förhindra befruktning av flera spermier, sa forskarna.

Denna frisättning sammanfaller med en kraftig ökning av fosforylering för många signalproteiner och andra som spelar en roll för att generera kontraktionsvågor på äggets yta omedelbart efter befruktningen.

Ägget utsöndrar också flera proteinnedbrytande enzymer utanför cellen, som forskare misstänker hjälper till att blockera flera befruktningshändelser genom att förstöra spermibindande proteiner. I ett något paradoxalt fynd, laget observerade också en ökning av proteiner som hämmar aktiviteten hos proteinnedbrytande enzymer. Anledningarna, dock, förblir oklara och erbjuder en väg för framtida studier.

"Vi kunde observera både nya och tidigare kända funktioner i cellcykeln, men vi kunde också lösa upp andra stora händelser som händer parallellt, "Presler sa." Befruktning sker genom samordning av tusentals molekyler samtidigt, och för första gången har vi en möjlighet att förstå det i denna skala. "

Den nya metoden möjliggör mått på de absoluta nivåerna av proteiner och fosforylering genom en kombination av tekniska och matematiska metoder. Det representerar en betydande förbättring jämfört med vanliga storskaliga proteinanalyser som kan göra den exakta förutsägelsen av funktionella skillnader utmanande.

Genom att avsevärt förbättra den detalj och skala vid vilken forskare kan studera proteinsammansättning och modifieringar, även över tidens smala fönster, teamet tror att dessa tekniker kan tillämpas på många biologiska system.

"För att förstå och bota sjukdomar, vi behöver en mer exakt förståelse av vad som händer normalt, hälsosamma processer, "Presler sa." Vi frågade vad de molekylära skillnaderna mellan ett befruktat och ofertiliserat ägg var, men detta tillvägagångssätt är omedelbart tillämpligt för att studera andra viktiga frågor, såsom skillnaderna mellan celler som är i friska och sjukdomstillstånd. "

"Proteinbiokemi driver mycket av cellens funktion, och denna metodik kan ge oss en mer fullständig bild av hur celler gör vad de gör, " han sa.