Ett Penn State-ledda team av tvärvetenskapliga forskare har utvecklat tekniker för att förbättra effektiviteten hos CRISPR-Cas9, genomredigeringstekniken som fick Nobelpriset 2020. Även om CRISPR-Cas9 är snabbare, billigare och mer exakt än annan genredigering metoder, enligt projektledaren Xiaojun "Lance" Lian, docent i biomedicinsk teknik och biologi vid Penn State, har tekniken begränsningar - särskilt i tillämpningar för att förbättra människors hälsa.

Forskarna utvecklade en mer effektiv och tillgänglig process för att applicera CRISPR-Cas9-system i mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs), härledda från federalt godkända stamcellslinjer, som Lian sa att mycket skulle kunna förbättra diagnostik och behandlingar för genetiska störningar. Metoden publicerades den 7 september i Cell Reports Methods .

CRISPR-Cas9, som står för clustered regularly interspaced short palindromic repeats och CRISPR-associated protein 9, ger forskare möjligheten att rikta in exakta platser för genetisk kod för att ändra DNA, vilket ger möjligheter att skapa nya diagnostiska verktyg och potentiellt korrigera mutationer för att behandla genetiska orsaker av sjukdom.

"Det mänskliga genomet är enormt, och CRISPR-Cas9 gör det möjligt för forskare att hitta och rikta in sig på en muterad gen i syfte att studera den," sa Lian.

CRISPR använder en skiva av genetiskt material, känd som plasmid-DNA, för att leverera guidad ribonukleinsyra (RNA) som placerar Cas9-enzymet på den exakta platsen för målgenen. När DNA:t är lokaliserat binder Cas9 till det och skär ut det, vilket gör att annat DNA kan reparera skäret. Forskare kan sedan se hur borttagandet förändrar genens uttryck. Men det finns problem med leverans- och redigeringseffektivitet med nuvarande DNA-baserade CRISPR-metoder, enligt Lian.

"Leveransen av DNA CRISPR-effektorer är låg," sa han. "Endast 20% till 30% av målcellerna kommer att få genredigerande DNA när man använder CRISPR. Leverans av RNA till celler kan vara effektivare, men när vanligt RNA introduceras kan cellerna se det som ett virus. De förstör RNA innan det kan göra proteiner - säg inom några timmar - och, genom att göra det, förstöra genredigeringsförsöket."

För att förbättra resultatet ändrade forskarna hur genomredigeringsverktygen levereras till stamcellerna med hjälp av modifierat RNA (modRNA). ModRNA:t skiljer sig från plasmid-DNA genom att det ersätter ett av bassubstraten som finns i RNA med en kemiskt modifierad version, och det stabiliseras av starkare strukturellt stöd.

"ModRNA visade sig vara särskilt effektivare än plasmid-DNA," sa Lian. "Omkring 90 % av cellerna fick modRNA från en enkel transfektion, så det kunde förbli på plats och göra sitt jobb."

Forskarna fann också att den tid som modRNA var på plats var idealisk:tillräckligt lång för att modifiera cellerna men inte så lång att det orsakade aktivitet utanför målet. Men modRNA introducerade en annan fråga, enligt Lian.

När modRNA Cas9 framgångsrikt levereras till målgenen skapar det ett dubbelsträngat brott i genomet, som vissa celler kommer att försöka fixa. De som fixar sig själva kan skicka reparationen, eller "mutationen", till sin avkomma. Det är denna process som forskare vill förstå bättre, så det är dessa celler de vill skörda och studera. Problemet, sa Lian, är att de flesta celler med denna paus identifierar det som ett stort problem med genomet och kommer att förstöra sig själv istället för att försöka reparera sig själva.

För att minska de toxiska biverkningarna av Cas9 och hjälpa redigerade celler att överleva, introducerade Lians team ett litet protein som är känt för att hjälpa celler att växa. Enligt Lian hämmade detta tillsatta protein celldöd och förbättrade Cas9-redigeringseffektiviteten upp till 84 %.

Forskarna fann också att modRNA kunde förbättra andra genredigeringstekniker, såsom basredigering. Basredigering kan slå ut gener eller korrigera mutationer i genomet genom att använda ett protein för att ändra en enda nukleotid istället för att skära av båda strängarna, som CRISPR gör.

"Vi transfekterade stamceller med antingen ett plasmidbaserat eller ett modRNA-baserat basredigeringsprotein," sa Lian. "Vår modRNA-baserade metod var mer än fyra gånger effektivare, med 68 %, än den plasmidbaserade tekniken, med cirka 16 %, för att framgångsrikt redigera genomet."

Enligt Lian kommer forskare att bättre förstå gener och deras funktioner snabbare eftersom fler genredigeringslabb förbättrar genredigeringseffektiviteten och effektiviteten.

"Människroppen har mer än 20 000 gener, men vi studerar funktionerna hos endast cirka 10% av dem," sa Lian. "Att undersöka syftet med varje kvarvarande gen, en i taget, kan ta en livstid. Att använda konstruerade stamceller från våra mycket effektiva genredigeringstekniker kan avsevärt påskynda denna process." + Utforska vidare

Att studera sjukdomar med bättre leverans av genredigeringsverktyg