Syntetiska biologer vid Rice University har utvecklat den första tekniken för att observera realtidsaktiviteten hos några av de vanligaste signalbehandlingskretsarna i bakterier, inklusive dödliga patogener som använder kretsarna för att öka sin virulens samt för att utveckla antibiotikaresistens.

Tvåkomponentsystem är sensoriska kretsar som bakterier använder för att reagera på sin omgivning och överleva. Bakterier använder kretsarna, som också är kända som signaltransduktionsvägar, för att känna av ett "oöverträffat utbud av stimuli" från ljus och metalljoner till pH och till och med meddelanden från sina vänner och grannar, säger Rice bioteknikprofessor Jeffrey Tabor.

Tabor och postdoktorn Ryan Butchers nya optiska verktyg för att observera fosforyleringsreaktioner i realtid i tvåkomponentsystem beskrivs i en studie som publicerades denna vecka i Proceedings of the National Academy of Sciences .

"Bakterier använder tvåkomponentsystem för att aktivera virulens och antibiotikaresistens, kolonisera människo- och växtvärdar, bilda biofilmer och ful medicinsk utrustning", säger Tabor, professor i både bioteknik och biovetenskap.

Tabors laboratorium har studerat tvåkomponentsystem i flera år. Under 2019 presenterade hans team en verktygssats för biohacking som syntetiska biologer kan använda för att blanda och matcha tiotusentals sensoriska input och genetiska utdata från kretsarna.

En av de viktigaste användningsområdena för den verktygslådan var att låsa upp det dubbla mysteriet med tvåkomponentsystem. Som namnet antyder har kretsarna två funktioner:att känna av en stimulans utanför cellen och att ändra cellens beteende som svar på den stimulansen.

Den första komponenten, känd som ett sensorkinas, sticker vanligtvis ut genom cellens yttre vägg och kan endast aktiveras av en specifik kemisk signal. När den väl utlösts sätter den igång en biokemisk kaskad, en kedjereaktion inuti cellen som slutar med att cellen ändrar sitt beteende som svar på stimuli.

Det första steget i kaskaden är en process som kallas fosforylering, som i slutändan resulterar i aktivering av den andra komponenten i systemet, responsregulatorn.

Även om fosforyleringsreaktioner är nyckeln i de tiotusentals tvåkomponentsystem som används i bakterier, har det varit mycket svårt att direkt observera dem i levande bakterier. Det beror delvis på att responsregulatorer vanligtvis måste gå samman för att bilda par för att fortsätta den biologiska kaskaden som leder till stimulussvar.

"Experimentell analys av fosforylering kräver ofta rening av proteiner från bakterier och analys med mödosamma in vitro-metoder som gelelektrofores," sa Butcher.

Butcher skapade en mycket enklare metod som använder fluorescerande proteintaggar och polariserat fluorescerande ljus. Han konstruerade stammar av E. coli för att producera mNeonGreen fluorescerande proteinsonder som depolariserar ljus från en excitationslaser, men bara om de interagerar som par. I en mängd olika tester visade Butcher och Tabor att deras metod kunde användas för att övervaka storleken och hastigheten på aktivering av responsregulatorer under en mängd olika miljöförhållanden.

Metoden kallas "homotypisk fluorescensresonansenergiöverföring" eller förkortat homo-FRET. Tabor sa att forskare kan använda det för att följa aktiveringen av tvåkomponentsystem med mycket högre tidsupplösning än tidigare möjligt.

I studien visade han och Butcher användbarheten av homo-FRET genom att observera ett nitrataktiverat tvåkomponentsystem som är känt för att spela en roll i gastrointestinal kolonisering av E. coli, Salmonella och andra patogener.

"Mikrobiologer har känt till ett tag att denna genetiska krets används av ett antal patogener, men vi förstår fortfarande inte helt hur det fungerar," sa Tabor.

Med hjälp av sin metod upptäckte Tabor och Butcher en tidigare orapporterad aktivitetspuls i kretsen som svar på att tillsätta nitrat. Pulsen verkar uppstå på grund av snabb aktivering av tvåkomponentsystemet följt av konsumtion av nitrat av bakterierna och motsvarande deaktivering.

"Det är ett fönster till hur den här kretsen fungerar, och det är den typ av sak som skulle ha varit mycket svårare att fastställa med tidigare metoder," sa Tabor. "Med homo-FRET kan vi se hur kretsen reagerar på ändrade nitratnivåer när det händer."

"Vi tror att homo-FRET kan användas för att konstruera biosensorer som svarar 10 gånger snabbare än nuvarande alternativ, och att vi och andra kommer att kunna använda den för att göra nya upptäckter i en rad andra bakterievägar," sa han. + Utforska vidare

Syntetiska biologer hackar bakteriesensorer