CRISPR/Cas9 är fortfarande det mest kraftfulla verktyget för att generera mutationer i växtgenom. Att studera de olika kombinationerna av mutationer har avsevärt ökat omfattningen av experimentella uppställningar, vilket kräver mer utrymme för att odla många växter.
Forskare från VIB-UGent Center for Plant Systems Biology har förbättrat multiplex mutagenes, vilket minskar komplexiteten och kostnaderna för storskaliga genomredigeringsprojekt. Deras resultat har publicerats i The Plant Journal .
CRISPR/Cas-experiment ökar kontinuerligt i skala, inte bara när det gäller antalet mutanter som skapas genom exakt genomredigering utan också när det gäller antalet gener som kan muteras samtidigt. Thomas Jacobs labb från VIB-UGent Center for Plant Systems Biology har utvecklat skärmar för att systematiskt mutera tiotals, hundratals eller till och med tusentals gener åt gången.
Målet är att förbättra effektiviteten hos ärftliga könscellsmutationer och i slutändan minska komplexiteten och kostnaderna för storskaliga genomiska redigeringsprojekt.
För att uppnå detta fokuserade teamet på två nyckelaspekter av CRISPR/Cas9-vektordesign:promotorn för att driva Cas9-uttryck och de nukleära lokaliseringssignalerna (NLS) som leder proteinet till kärnan. Genom att genotypa tusentals Arabidopsis-växter fann de att användning av RPS5A-promotorn för att uttrycka Cas9 ledde till den högsta mutationshastigheten, och att flankering av Cas9-proteinet med bipartit NLS var den mest effektiva konfigurationen för att skapa könscellsmutationer.
Att kombinera dessa två element resulterar i den högsta observerade multiplexredigeringseffektiviteten, med 99 % av växterna som har minst en knockout-mutation och över 80 % med 4 till 7 mutationer.
"Detta representerar ett betydande framsteg inom området växtgenetik och ger ett tillförlitligt och effektivt verktyg för forskare som fokuserar på komplex genteknik. Vad jag tycker är särskilt intressant är effekten av NLS. Jag vågar säga att det hade en starkare effekt än främjandet av ," sa Dr. Thomas Jacobs, gruppledare vid VIB-UGent Center for Plant Systems Biology
Optimeringarna som uppnåtts i studien minskar avsevärt komplexiteten och kostnaderna för storskaliga genomredigeringsprojekt inom växtvetenskap. För att uttrycka det i siffror:med deras tidigare vektor beräknades en CRISPR-skärm som letade efter alla dubbla knockouts av bara 20 gener kräva en population på cirka 18 000 växter. Med de nya vektorerna borde det ta cirka 3 000 plantor.
"Dessa optimeringar kommer att vara användbara för att generera högre ordning knockouts i könslinjen av Arabidopsis och sannolikt tillämpas på andra CRISPR-system också," säger Ward Develtere, Ph.D. student och huvudförfattare till rapporten.
Mer information: Ward Develtere et al, Kontinuerlig förbättring av CRISPR-inducerad multiplex mutagenes i Arabidopsis, The Plant Journal (2024). DOI:10.1111/tpj.16785
Journalinformation: The Plant Journal
Tillhandahålls av VIB (Flanders Institute for Biotechnology)
