Vaniljextrakt är en av de mest använda smakämnena i livsmedel och kosmetika. Den behagliga och söta doften av denna klassiska smak förmedlas av den kemiska föreningen "vanillin" som finns i fröna från vaniljväxter som tillhör orkidéfamiljen. I växter syntetiseras vanillin genom omvandling av ferulsyra av enzymet VpVAN. Laboratoriebiosyntes av vanillin från växthärlett VpVAN ger dock endast mycket små mängder vanillin och är därför kommersiellt opraktisk.
Dessutom, även om kemiskt framställda vaniljessenser är tillgängliga billigt, matchar de inte smaken av naturligt vaniljextrakt, och efterfrågan på det senare fortsätter att vara hög. Dessutom har klimatrestriktioner för odling av vaniljplantor, och den relativt lilla avkastningen per planta, lett till ett minskande utbud och en ökning av priset på naturligt vaniljextrakt.
För att ta itu med dessa utmaningar utvecklade professor Toshiki Furuya från Institutionen för tillämpad biologisk vetenskap, fakulteten för naturvetenskap och teknik, Tokyos naturvetenskapliga universitet, och hans doktorander Shizuka Fujimaki och Satsuki Sakamoto, framgångsrikt ett enzym som genererar vanillin från ferulsyra från växter.
"Ferulsyra, råvaran, är en förening som kan erhållas i överflöd från jordbruksavfall som riskli och vetekli. Vanillin genereras helt enkelt genom att blanda ferulsyra med det utvecklade enzymet vid rumstemperatur. Så, den etablerade tekniken kan tillhandahålla en enkel och miljövänlig metod för att producera smakföreningar", förklarar Prof. Furuya. Deras studie publicerades den 10 maj 2024 i Applied and Environmental Microbiology .
Forskarna använde genteknik för att modifiera molekylstrukturen hos ett enzym - "Ado." Ado är ursprungligen ett oxidasenzym som tillför en syreatom till substratet – isoeugenol.
I sitt ursprungliga tillstånd har den inte förmågan att omvandla ferulsyra till vanillin. Med hjälp av strukturell modelleringsanalys kunde forskarna förutsäga aminosyraförändringar i Ado som skulle möjliggöra dess interaktion med ferulsyra.
På dessa linjer genomförde de en serie experiment genom att ersätta aminosyrarester av fenylalanin och valin på specifika positioner i strukturen av Ado, med olika andra aminosyror. De fortsatte med att undersöka förmågan att omvandla ferulinsyra hos de olika konstruerade mutantproteinerna.
Efter flera försök och misstag fann de att ett mutantprotein i vilket endast tre specifika fenylalanin- och valinrester ersattes med tyrosin och arginin, reagerade stabilt med ferulsyra och uppvisade hög omvandlingsaktivitet. Noterbart är att det konstruerade enzymet inte krävde några kofaktorer för omvandling, till skillnad från andra oxidaser, och producerade vanillin i gramskala per liter reaktionslösning, med en högre katalytisk effektivitet och affinitet än den för vildtypsenzymet.
Reaktionen krävde bara blandning av enzymet, ferulsyra och luft (molekylärt syre), vid rumstemperatur, vilket gjorde det till en enkel, hållbar och ekonomiskt skalbar process. Dessutom uppvisade det molekylärt utvecklade enzymet också omvandlingsaktivitet mot p-kumarsyra och sinapinsyra, som är föreningar som erhålls från nedbrytningen av lignin – en vanlig jordbruksavfallsprodukt.
Hittills har inga mikrobiella eller växthärledda enzymer uppvisat förmågan att omvandla ferulsyra till vanillin i industriell skala. Därför visar enzymet som utvecklats i den aktuella studien betydande potential för att möjliggöra kommersiell och ekonomiskt lönsam produktion av naturligt vanillin.
Prof. Furuya förklarar de långsiktiga konsekvenserna av deras forskning, "Att utnyttja potentialen hos mikroorganismer och enzymer för att härleda värdefulla föreningar under milda förhållanden från förnybara växtbaserade resurser, erbjuder ett hållbart tillvägagångssätt för att minimera miljöavtryck.
"För närvarande, i samarbete med ett företag, fokuserar våra forskningssträvanden på att uppnå den verkliga implementeringen av vanillinproduktion genom att använda det nyutvecklade enzymet."
Mer information: Shizuka Fujimaki et al, Engineering ett koenzymoberoende dioxygenas för enstegsproduktion av vanillin från ferulsyra, Applied and Environmental Microbiology (2024). DOI:10.1128/aem.00233-24
Journalinformation: Tillämpad och miljömikrobiologi
Tillhandahålls av Tokyo University of Science
